RCCS模擬微重力環境對人胃黏膜上皮GES-1細胞代謝組學的影響

郭 松，陳正陽，楊佳啟，柴韶斌，徐冰心，孫宏偉，周金蓮，楊鶴鳴，崔 彥

外太空是一個集失重、輻射、高磁場、超低溫等因素的復雜環境，充斥著威脅航天員生命與健康的不穩定因素。隨著載人航天事業的飛速發展，微重力環境對機體的影響備受關注[1-2]。研究證實，微重力環境會對消化系統產生一系列不良影響，包括對消化液和消化道激素分泌、胃腸黏膜屏障、腸道微生態、胃腸道血液及淋巴循環、藥物動力學、藥物效應動力學及對肝臟、胰腺功能的影響等。保障航天員在執行航天任務及進行模擬微重力環境訓練過程中消化系統的穩定狀態，明確微重力環境對消化系統影響的機制，均亟待深入研究[3-4]。本課題在前期研究[5-7]的基礎上，應用旋轉式細胞培養系統(rotary cell culture system， RCCS)，研究模擬微重力環境對人胃黏膜上皮GES-1細胞代謝組學的影響，以期為未來基于微重力環境下代謝組學變化特征探討胃黏膜上皮相關疾病的發生發展機制及應對措施提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 人胃黏膜上皮GES-1細胞系(賽百慷生物技術股份有限公司)，RCCS(Synthecon，USA)，10 ml高截面縱橫比容器-D410(Synthecon，USA)，Cytodex-3微載體(Sigma，USA)，TCP-SP5-Ⅱ激光共聚焦顯微鏡(Leica Microsystems，Wetzlar，GER)，超高效液相色譜串聯飛行時間質譜儀(AB SCIEX，USA)。

1.2GES-1細胞培養和實驗分組 配制含10%胎牛血清，1%青霉素100 U/ml和鏈霉素100 mg/ml的DMEM培養基，選取3～10代處于對數生長期的人胃黏膜上皮GES-1細胞進行培養。將培養后的人胃黏膜上皮GES-1細胞隨機分為模擬微重力組(SMG組)和正常重力對照組(NG組)。

1.3RCCS模擬微重力細胞培養 將人胃黏膜上皮GES-1細胞以1×106個/ml密度與經磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、75%乙醇預處理的Cytodex-3微載體0.05 g混合，置入高截面縱橫比容器-D410并連接RCCS。SMG組的高截面縱橫比容器-D410軸心與地面平行，NG組于正常重力環境中培養，轉速設置為12 r/min。

1.4樣本采集 細胞培養1、3和5 d收集樣本。SMG組用5 ml注射器吸取高截面縱橫比容器-D410中的混合液體于15 ml離心管內，待細胞-微載體復合物沉淀后棄去上清液，用PBS溶液沖洗細胞-微載體復合物2遍，棄去上清液，隨后加入0.25%胰酶消化液2 ml，37℃消化5 min，1000 r/min離心5 min，用吸管吹打，使微載體上的細胞脫落，用70 μm細胞篩過濾，獲取單細胞懸液。NG組棄上清液，用PBS溶液沖洗2遍，后加入0.25%胰酶消化液2 ml，37℃消化5 min，獲取單細胞懸液。將2組單細胞懸液1000 r/min離心5 min，棄上清液，用液氮速凍后置-80℃冰箱待測。每組樣本進行6次生物學重復。

1.5樣品處理 取等量細胞樣品，加入提取液(甲醇︰乙腈︰水=2︰2 ︰ 1)1000 μl；經高通量組織破碎儀破碎(-20℃，60 Hz)，渦旋(30 s)混勻后，低溫超聲萃取10 min，重復3次，超聲萃取參數為5℃、40 kHz；再將樣品靜置于-20℃環境中30 min，在4℃、13 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，復溶液(乙腈︰水=1︰1)100 μl復溶，轉移至超高效液相色譜串聯飛行時間質譜儀進樣小瓶中上機進行檢測。

1.6LC/MS檢測 分析平臺為超高效液相色譜串聯飛行時間質譜儀，色譜條件：色譜柱BEH C18柱(100 mm×2.1 mm i.d，1.7 μm)，流動相A為水(含0.1%甲酸)，流動相B為乙腈/異丙醇(1/1)，設定流速為0.40 ml/min、進樣量為20 μl、柱溫為40℃。樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式，離子噴霧電壓。樣本洗脫梯度見表1，質譜源參數及碰撞能見表2。

表1 流動相洗脫梯度

表2 質譜源參數及碰撞能

1.7數據分析 將原始數據導入代謝組學處理軟件Progenesis QI進行基線過濾、峰識別及積分，保留時間校正、峰對齊，得到保留時間、質荷比和峰強度的數據矩陣，進行數據預處理：保留至少一組樣品中非零值80%以上的變量；原始矩陣中最小值填補缺失值；總峰歸一化，刪除QC樣本相對標準偏差>30%的變量，獲取用于后續分析的數據矩陣。Progenesis QI搜庫鑒定，將質譜信息與代謝數據庫進行匹配。主要數據庫為http://www.hmdb.ca/和https://metlin.scripps.edu。

1.8統計學方法 應用主成分分析(principal component analysis, PCA)，R2X>0.5說明PCA模型效果好，預測能力強。應用正交偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA)探討組間差異。變量重要性(VIP)評價自變量在解釋因變量時作用的重要性，篩選VIP>1的變量作為差異代謝物或潛在標志物。采用t檢驗結合多元OPLS-DA分析，篩選出2組間差異代謝物(同時滿足VIP>1，P<0.05)。

2 結果

2.1PCA分析 采用PCA建立模型，對樣本進行PCA分析，培養1、3、5 d的2組樣本模型參數分別為R2X=0.712、R2X=0.692、R2X=0.624，3個時間點R2X均>0.5。培養1、3、5 d樣本的PCA分析得分見圖1，2組不同培養時相分別聚類，每組的橢圓分離，表明模擬微重力環境對人胃黏膜上皮GES-1細胞的代謝產生影響；代謝物之間分離聚類，表明代謝物可作為潛在的生物標志物。

圖1 旋轉式細胞培養系統對模擬微重力環境下人胃黏膜上皮GES-1細胞主成分分析圖

2.2OPLS-DA分析 對培養細胞樣本進行OPLS-DA分析，結果顯示，培養1、3、5 d的2組樣本模型參數分別為R2Y=0.919、Q2=0.892，R2Y=0.957、Q2=0.944，R2Y=0.946、Q2=0.933,3個時間點模型參數均>0.5。培養1、3、5 d的2組代謝產物聚類明顯分離，見圖2，表明代謝產物有明顯差異。對樣本進行置換檢驗，以進一步檢驗OPLS-DA模型的預測性能，見圖3。經200次置換檢驗，得出R2=0.6018，Q2=-0.2192，數值均<1，表明模型穩定，預測性良好。

圖2 旋轉式細胞培養系統對模擬微重力環境下人胃黏膜上皮GES-1細胞正交偏最小二乘判別分析

圖3 旋轉式細胞培養系統對模擬微重力環境下人胃黏膜上皮GES-1細胞正交偏最小二乘判別分析置換檢驗結果

2.3差異代謝物篩選 對2組1、3、5 d的代謝產物采用多元OPLS-DA分析結合t檢驗，篩選出202種差異代謝物，2組培養1 d有151種差異代謝物，其中113種表達上調，38種表達下調；2組培養3 d有134種差異代謝物，其中109種表達上調，25種表達下調；2組培養5 d有154種差異代謝物，其中131種表達上調，23種表達下調。

2.4差異代謝物分析 將2組差異代謝物數據進行代謝物分析，通過Venn圖篩選出2組1、3、5 d的共同差異代謝物(VIP>1且P<0.05)74種，其中57種表達上調，17種表達下調，見圖4。通過KEGG數據庫，發現有具體名稱及相關功能的差異代謝物44種，主要包括磷脂、氨基酸、輔助因子及羧酸，見圖5。通過HMDB數據庫，發現這些代謝物的亞分類主要包括甘油磷脂酰膽堿(21.74%)、甘油磷脂酰乙醇胺(19.57%)、氨基酸及肽類(17.39%)等，見圖6。KEGG數據庫富集通路分析結果顯示，差異代謝物涉及脂類代謝、氨基酸代謝、輔酶和維生素代謝、神經遞質代謝、碳水化合物代謝、細胞增殖和凋亡、腫瘤調控、膜轉運、信號傳導等信號通路，見圖7。44種差異代謝物中31種表達上調，13種表達下調。磷脂類中磷脂酰膽堿有4種表達上調，2種表達下調；磷脂酰乙醇胺有5種表達上調，1種表達下調；磷脂酰甘油有2種表達上調；磷脂酰絲氨酸有2種表達下調；溶血磷脂共9種，表達皆上調；鞘脂類中鞘磷脂表達下調，鞘氨醇和鞘氨醇半乳糖表達上調，見表3。

表3 培養1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1細胞共同差異代謝物

圖4 培養1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1細胞共同差異代謝物Venn圖

圖5 培養1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1細胞差異代謝物KEGG數據庫化合物分類

圖6 培養1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1細胞差異代謝物HMDB數據庫化合物分類

圖7 培養1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1細胞差異代謝物KEGG數據庫富集通路分析

3 討論

GES-1細胞系為原代培養的胎兒正常胃黏膜上皮細胞,經過SV40病毒感染并經轉化分離后建立的可在體外長期穩定傳代的細胞系。除了良好的轉化特性外，GES-1細胞還保留了正常的細胞骨架結構，如微絲、微管、角蛋白，其黏蛋白反應陽性，以單層形式貼壁生長，可以在體外長期傳代，是一種比較理想的研究人胃黏膜正常上皮細胞的體外模型細胞[8-9]。

代謝組學作為系統生物學的重要組成部分，可對生物體內廣譜代謝產物進行定量分析并發現不同狀態下代謝產物的變化，從而明確生物體不同代謝產物與相應生理、病理狀態的關系，目前已廣泛應用于生命科學各領域，為詮釋生命現象、探尋疾病機制、研發藥物、發現生物學標志物等提供了強大的技術平臺，展現了嶄新的理論視角[10]。

本實驗應用代謝組學研究發現，RCCS模擬微重力環境對人胃黏膜上皮GES-1細胞的代謝產生明顯影響，其中對于脂質代謝物及脂質代謝通路的影響尤為顯著。模擬微重力環境使人胃黏膜上皮GES-1細胞的溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺、硬脂酰肉堿等表達增加，而鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰單甲基乙醇胺、油酰胺等表達減少?，F已明確，這些脂類代謝物是構成細胞膜結構的主要成分，與其穩定性和發揮正常功能密切相關。磷脂酰膽堿是構成細胞膜結構的主要成分，而溶血磷脂酰膽堿在膜上發揮溶解作用。溶血磷脂酰絲氨酸可誘導胃腔分泌型磷脂酶A2活性增加,其產物溶血磷脂酰膽堿能夠直接破壞胃的疏水層，并且可能導致胃屏障的破壞和炎癥的發生[11-12]。本課題組前期研究RCCS模擬微重力環境對人角化細胞及表皮干細胞代謝組學的影響，同樣發現模似微重力環境導致細胞的多種脂質代謝失調，并涉及細胞的氨基酸代謝通路、膜轉運通路及脂質代謝通路等[13-14]。細胞膜結構包括細胞膜、內質網膜、高爾基體膜、核膜、線粒體膜、溶酶體膜等，均以磷脂雙分子層為基本骨架。暴露于微重力環境中的細胞膜結構變化，早年即引起學術界的關注，但相關機制一直未能明確[15-16]。郭彪等[5]進行尾懸吊模擬失重大鼠實驗，發現失重可導致胃黏膜超微結構改變及氧化應激損傷，持續尾懸吊可導致胃黏膜細胞膜脂質過氧化損傷，超微結構異常，胃黏膜層變薄，分泌及屏障功能受損。結合文獻分析認為，微重力環境下人胃黏膜上皮GES-1細胞脂質代謝發生變化，影響細胞膜結構的穩定性，達到一定閾值將導致膜屏障功能受損、細胞內環境紊亂、物質和能量交換及信息傳遞障礙、藥物代謝受影響[17]等一系列問題。

本研究結果還提示，在RCCS模擬微重力環境中人胃黏膜上皮GES-1細胞的增殖、分化、凋亡發生變化。代謝物變化包括PE(18∶1(11Z)/15∶0)表達增加；SM(d18∶0/16∶1(9Z))表達減少，而其代謝產物Sphingosine和Galactosylsphingosine表達增加；L-谷氨酸、D-色氨酸、酪氨酸、酪氨酰色氨酸、賴氨酰纈氨酸、谷胱甘肽、2-(S-谷胱甘肽)乙酰基谷胱甘肽、L-異亮氨酸和纈氨酸等氨基酸類化合物表達亦增加。KEGG數據庫富集通路分析亦顯示，模擬微重力環境中人胃黏膜上皮GES-1細胞的差異代謝物涉及細胞增殖和凋亡通路。已有研究證實，人和哺乳類動物的質膜中富含磷脂酰乙醇胺，其已成為細胞凋亡分子檢測研究的重要目標[18]。鞘脂是一類具有廣泛生理功能和病理作用的脂類物質，而鞘磷脂為細胞鞘脂的主要成分，在細胞的質膜結構和細胞功能方面發揮重要作用，受鞘磷脂代謝通路調控，參與細胞的增殖、生長、凋亡及炎癥修復[19-20]。據Zhu等[21]研究報道，回轉器模擬微重力環境使胃癌SGC-7901細胞72 h時凋亡增加，胃黏膜上皮HFE-145細胞在12 h時凋亡即顯著增加。顯然，在微重力這一極為特殊的環境刺激下，機體細胞會發生一系列應激反應，而凋亡變化則為一種普遍存在的生理/病理現象，在應激反應和代償/失代償生物學過程中發揮重要作用[22]。中長期微重力環境對胃黏膜上皮細胞增殖、分化和凋亡的影響及機制尚待進一步研究。

本研究還發現，腫瘤和炎癥相關聯的代謝物亦發生變化。胃腸道腫瘤和炎性細胞含有活化的鞘脂代謝酶，包括鞘氨醇激酶1和鞘氨醇激酶2，它們會產生具有高生物活性的鞘氨醇-1-磷酸，一般炎癥反應與循環鞘氨醇-1-磷酸有關，腫瘤患者血漿和淋巴中多存在高濃度的鞘氨醇-1-磷酸[23]。模擬微重力環境下人胃黏膜上皮GES-1細胞的鞘磷脂等代謝異常，有可能影響細胞的精細功能包括腫瘤性轉化[24]。我們研究發現，模擬微重力環境下人胃黏膜上皮GES-1細胞發生SM表達下調的同時，Sphingosine和Galactosylsphingosine表達上調。據文獻報道，Sphingosine和Galactosylsphingosine定位于脂質筏并擾亂膜的完整性，且可抑制蛋白激酶C向質膜的轉運[25]。KEGG數據庫富集通路分析結果顯示，模擬微重力環境中人胃黏膜上皮GES-1細胞的差異代謝物同樣涉及腫瘤調控通路。微重力環境對腫瘤的影響，已引起學術界的重視[26]。本課題組前期進行模擬微重力對人HGC-27胃癌細胞的研究，代謝組學分析顯示，RCCS模擬微重力環境主要影響人HGC-27胃癌細胞的脂質代謝，同時發現RCCS模擬微重力環境下人HGC-27胃癌細胞的增殖、細胞周期和超微結構發生顯著變化。顯然，微重力環境下人HGC-27胃癌細胞在代謝組學水平和超微結構層面發生了重要變化[6-7]。故探討微重力環境下機體細胞的腫瘤性轉化特點抑或觀察微重力環境對腫瘤細胞的影響，對豐富航天醫學基礎理論、為航天員長期駐留太空提供醫學保障均具有重要意義。