異甘草酸鎂對肺纖維化大鼠的保護作用及機制研究

高 瑕，馮 同，李萬成

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種臨床上常見的以中老年人群發病為主的間質性肺疾病，發病率約為10/10萬，病因及發病機制目前尚不清楚，臨床預后差[1]。近年來，IPF發病率呈明顯上升趨勢，引起了世界各國的高度關注[2-5]。IPF的主要臨床表現為進行性呼吸困難加重，晚期可出現咳嗽、咳痰、乏力、消瘦，因缺乏有效治療藥物，5年生存率低于50%，患者最終多死于呼吸衰竭[6-7]。目前，臨床治療IPF仍以糖皮質激素為主，但療效欠佳，且長期使用存在嚴重的毒副作用[8-9]，因此應用受限。吡非尼酮作為抗纖維化的新型藥物，可有效抑制肺功能下降、改善患者呼吸困難癥狀，但此藥物也因價格昂貴，并且具有較大的肝毒性、光毒性等不良反應[10-11]，導致臨床應用較少。因此，明確IPF的發病機制及尋找一種可有效作用于該機制靶點的藥物就顯得極為迫切。近來研究表明中藥類制劑甘草酸在肺纖維化防治方面起重要作用[12]。異甘草酸鎂(MgIG)是一種肝細胞保護劑，為第四代甘草酸制劑[13]，Yang等[14]研究發現在放射性肺纖維化模型中，MgIG表現出較好的抗纖維化作用。但目前關于MgIG對博來霉素誘導肺纖維化大鼠的治療作用報道甚少，因此本實驗通過氣管內注射博來霉素來構建肺纖維化大鼠模型，旨在研究MgIG對層黏連蛋白(LN)、透明質酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)及羥脯氨酸(Hyp)表達的影響，探索MgIG對肺纖維化的保護作用機制，以期為臨床防治肺纖維化找到新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物 24只8～10周成年、雄性SPF級健康SD大鼠，體質量(200.0±20.0)g，由成都達碩實驗動物有限公司提供。大鼠在通風良好、光照適宜、溫度和濕度合適的環境中適應性飼養1周。

1.2主要試劑 博來霉素(成都梓誠奕博生物科技有限公司生產)，MgIG注射液(正大天晴藥業集團股份有限公司生產)，HE染色試劑盒(武漢Boster生物工程有限公司生產)，Masson染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司生產)，LN、HA、Hyp檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所生產)，PCⅢ檢測試劑盒(上海康朗生物科技有限公司生產)，TGF-β1檢測試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司生產)。

1.3主要方法

1.3.1動物模型制備：將預先備好的大鼠隨機分為對照組、模型組、干預組，每組8只。標準飼養1周后將大鼠稱重，10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠的頭部及四肢用皮筋固定于操作臺上，碘伏棉球消毒大鼠頸部皮膚，在無菌操作下切開頸部皮膚1～2 cm，止血鉗逐層鈍性分離組織，充分暴露氣管。模型組及干預組大鼠用1 ml注射器穿刺向氣管內注射博來霉素溶液(5 mg/kg)，對照組大鼠于氣管內注入等量0.9%氯化鈉注射液。注射后立即將大鼠上下、左右旋轉5 min，使藥物盡可能均勻分布于肺部。

1.3.2藥物干預：肺纖維化大鼠模型構建成功后24 h，干預組大鼠腹腔注射MgIG注射液30 mg/(kg·d),余2組每日腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，連續干預28 d。

1.3.3標本采集：大鼠血清標本采集：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，固定于操作臺上，消毒、備皮，切開腹腔，取腹主動脈近心端全血4 ml，室溫靜置2 h后置入離心機中3000 r/min離心15 min，取上清液于-80℃環境保存備用，待全部血清采集完畢后按照各檢測試劑盒要求進行操作。肺組織標本采集：切開大鼠胸骨，結扎氣管，取大鼠全肺，用0.9%氯化鈉注射液清洗、濾紙擦凈肺表面多余水分后稱重，計算肺系數(肺濕質量/肺體質量)，并將左肺下葉組織固定于4%多聚甲醛中，放置于4℃冰箱中至少24 h后行組織脫水、石蠟包埋、切片(厚度約3 μm)，再行HE染色、Masson染色后顯微鏡下觀察。參照Szapiel等[15]方法對肺泡炎及肺纖維化程度進行評分，無肺泡炎為0分、肺泡炎面積<20%為1分、肺泡炎面積20%～50%為2分、肺泡炎面積>50%為3分，無纖維化為0分、纖維化面積<20%為1分、纖維化面積20%～50%為2分、纖維化面積>50%為3分。取右肺下葉組織保存于-80℃冰箱用于Hyp含量測定。

1.3.4肺組織Hyp含量測定：取100 mg新鮮大鼠右肺下葉組織，加入組織裂解液1 ml，震蕩混勻，于100℃水中水解20 min；取4 ml反應試劑，混勻(注意全程pH維持在6.0～6.8)，高溫水浴鍋中靜置20 min后取出，放置室溫中待自然冷卻后離心15 min，取上清液于波長550 nm處測定其吸光度值，并計算Hyp含量。

2 結果

2.1大鼠肺組織大體改變 對照組：肉眼觀大鼠肺組織形態正常，表面光滑、濕潤，呈粉紅色，彈性較好。模型組：與對照組比較，肺組織體積明顯縮小，表面凹凸不平，缺血面積大，呈暗紅色，彈性差。干預組：肺組織大體形態介于對照組及模型組之間，體積稍縮小，表面較紅潤，局部凹凸不平、有散在出血點，彈性欠佳。

2.2大鼠肺組織病理學改變

2.2.1肺組織HE染色：對照組：大鼠肺組織肺泡形態、結構均完整，肺泡間隔清晰可見，無充血、水腫，幾乎無炎性細胞浸潤及纖維滲出。模型組：肺泡壁結構斷裂，肺泡形態結構破壞明顯，肺泡腔內見大量炎性細胞及膠原纖維滲出。干預組：肺泡結構部分破壞，較多炎性細胞及膠原纖維滲出，但程度較模型組輕。見圖1。

圖1 3組大鼠肺組織HE染色所示(×100) 對照組為未造模大鼠組，模型組為肺纖維化大鼠組，干預組為異甘草酸鎂干預的肺纖維化大鼠組

2.2.2肺組織Masson染色：對照組：大鼠肺組織肺泡結構清晰，形態結構正常，有極少許藍色膠原纖維沉積。模型組：大鼠肺組織形態、結構破壞明顯，鏡下見大量藍色膠原纖維沉積。干預組：大鼠肺泡組織結構部分破壞、融合，見較多膠原纖維沉積，相較模型組藍色膠原纖維面積有所減少，纖維化程度有所減輕。見圖2。

圖2 3組大鼠肺組織 Masson染色所示(×100) 對照組為未造模大鼠組，模型組為肺纖維化大鼠組，干預組為異甘草酸鎂干預的肺纖維化大鼠組

2.3大鼠肺系數、肺泡炎評分、肺纖維化評分比較 與對照組大鼠比較，模型組和干預組大鼠肺系數、肺泡炎評分、肺纖維化評分均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；相較模型組大鼠，干預組大鼠上述指標均有所下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠肺系數、肺泡炎評分、肺纖維化評分

2.4大鼠血清肺纖維化指標比較 與對照組大鼠比較，模型組和干預組大鼠血清LN、HA、PCⅢ含量均明顯增加(P<0.05)；相較模型組大鼠，干預組大鼠血清LN、HA、PCⅢ含量均有所下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠血清肺纖維化指標比較

2.5大鼠血清TGF-β1含量比較 與對照組大鼠比較，模型組和干預組大鼠血清TGF-β1含量明顯增加(P<0.05)；與模型組大鼠比較，干預組大鼠血清TGF-β1含量明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 3組大鼠血清TGF-β1含量比較 對照組為未造模大鼠組，模型組為肺纖維化大鼠組，干預組為異甘草酸鎂干預的肺纖維化大鼠組；TGF-β1為轉化生長因子-β1；與對照組比較，aP<0.05;與模型組比較，cP<0.05

2.6大鼠肺組織Hyp含量比較 與對照組大鼠比較，模型組和干預組大鼠肺組織Hyp含量明顯增加(P<0.05)；與模型組大鼠比較，干預組大鼠肺組織Hyp含量有所下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 3組大鼠肺組織Hyp含量比較 對照組為未造模大鼠組，模型組為肺纖維化大鼠組，干預組為異甘草酸鎂干預的肺纖維化大鼠組；Hyp為羥脯氨酸；與對照組比較，aP<0.05;與模型組比較，cP<0.05

3 討論

IPF是一種病因及發病機制復雜的疾病，主要病理改變為肺泡腔內大量炎性細胞浸潤、肺泡間隔斷裂和肺間質纖維化[16-18]。研究表明，氣管內注入博來霉素誘導的肺損傷動物模型與人肺纖維化改變極其相似，是目前國內外最經典的造模方法[19]。因此，本實驗也采用氣管內注射博來霉素來誘導肺纖維化模型，肺組織病理結果顯示：肺泡形態結構破壞明顯，肺泡壁結構斷裂，肺泡腔內見大量炎性細胞滲出及大量藍色膠原纖維沉積，表明本實驗構建的肺纖維化大鼠模型是成功的。

MgIG是第四代甘草酸提取物，于21世紀初應用于臨床，是單一構型的18α-甘草酸制劑，與一代、二代、三代甘草酸提取物比較，具有腸道吸收好、療效佳、不良反應小、安全性高、肝臟靶向性高等優點，被廣泛用于肝炎和肝纖維化的治療[20]。近來研究表明，MgIG可有效減輕百草枯中毒導致的肺損傷及放射性肺纖維化[21-22]。

TGF-β1由淋巴細胞、上皮細胞、單核細胞及成纖維細胞等多種細胞產生，是轉化生長因子-β家族中的一種亞型[23]，在機體免疫、損傷修復、基質形成等過程中起重要作用。TGF-β1是目前公認的最強的致纖維化細胞因子，其激活與疾病的發生發展有著密切的關系[24]。研究發現，在博來霉素誘導肺纖維化模型中，TGF-β1的表達顯著升高，而進行藥物干預后TGF-β1表達下調，且小鼠炎癥反應及纖維化程度得到明顯改善，提示TGF-β1在肺纖維化中起著重要作用[25-26]。本實驗結果顯示，TGF-β1在模型組中水平升高，而在干預組中水平較模型組降低，提示MgIG可下調博來霉素誘導的肺纖維化大鼠模型中TGF-β1的表達。

Hyp是膠原纖維特有的氨基酸，在肺纖維化組織中的表達明顯增強，是反映肺纖維化程度的重要指標[27]。LN是構成細胞外基質的一種非膠原糖蛋白，由內皮細胞、上皮細胞產生，與膠原一起構成基底膜成分，其是細胞黏著于基質的介質，調節細胞的生長與分化。研究發現，在博來霉素誘導的肺纖維化大鼠模型中，LN表達較對照組明顯升高，提示LN參與了肺纖維化形成過程[28]。HA是一種酸性黏多糖，主要由成纖維細胞分泌產生，廣泛分布于細胞外基質，是細胞外基質的主要成分之一。研究表明，在間質性肺疾病患者中HA水平升高[29]，提示HA也參與了肺纖維化的形成。PCⅢ作為Ⅲ型膠原的前體，也是組成細胞基質的重要成分，其血清含量反映了膠原纖維合成及代謝情況[30-31]。在IPF患者血清中發現，PCⅢ水平較對照組顯著升高，其可作為評估肺纖維化嚴重程度的重要指標[32]。本實驗結果提示，在博來霉素誘導的肺纖維化大鼠模型中，Hyp、LN、HA、PCⅢ水平較對照組升高，故再次證明本實驗肺纖維化模型的構建成功，這也為臨床診斷肺纖維化提供了可靠的指標。

綜上，MgIG可能通過抑制TGF-β1、LN、HA、PCⅢ、Hyp水平進而改善博來霉素誘導大鼠肺泡炎及肺纖維化程度。