Beclin1和Ki67在肺腺癌組織中的表達及其臨床意義▲

張秀玲 龐 晨 葉星江 劉姍姍 張錫流

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院病理科，南寧市 530001，電子郵箱：414845910@qq.cm)

肺癌是世界各國常見的惡性腫瘤，其發病率及死亡率位居惡性腫瘤之首[1-2]，其也是廣西高發的惡性腫瘤之一[3]，且發病率有逐年增長之勢[4]。肺腺癌早期癥狀隱匿，不易發現，發現時已多為晚期，并伴多部位轉移[5]。自噬與腫瘤的發生和發展關系密切，是目前的研究熱點。Beclin1是自噬的重要調控因子，可調節細胞內自噬活性[6]。研究顯示，Beclin1蛋白在肺腺癌組織中表達，但其表達水平不一致，且機制未明[7-8]。Ki67是判斷細胞增殖能力的重要指標，其陽性表達率與腫瘤細胞增殖活躍程度密切相關[9]，并且臨床上已將其作為重要的腫瘤風險評估指標，用于判斷腫瘤的進展、惡性程度等，具有重要的生物學意義及臨床意義[10]。Beclin1與Ki67在肺腺癌中的表達關系如何，還未見相關報道。本研究探討自噬相關蛋白Beclin1與Ki67在肺腺癌中的表達及其臨床意義，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年10月至2019年10月在廣西中醫藥大學第一附屬醫院進行手術的100例肺腺癌患者的癌組織標本及相應的癌旁組織標本。納入標準：初診患者且臨床資料完整。排除標準：手術前接受過放療、化療等抗癌治療；合并其他惡性腫瘤等。記錄肺腺癌患者的臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤-淋巴結-遠處轉移(tumor-node-metastasis,TNM)分期、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況。本研究經醫院醫學倫理委員會審核并獲得批準。

1.2 主要儀器及試劑 HH-B11型電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)；BCD-227B型立式冷藏柜(青島海爾股份有限公司)；BX41-SD02光學顯微鏡(Olympus公司)。鼠抗人Ki67單克隆抗體(一抗/即用型，福建邁新公司，批號：1907170672h、190704S407b)；Beclin1單克隆抗體(一抗，美國Abcam公司，批號：GR3204186-2)；即用型快捷免疫組化MaxVision-HRP鼠/兔(通用二抗，福建邁新公司，批號：190704S407b)。

1.3 免疫組化法檢測Beclin1與Ki67的表達 將肺腺癌組織標本及癌旁組織標本用10%福爾馬林溶液固定，常規石蠟包埋及并制作切片(厚度4 μm)，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(streptavidin-peroxidase,SP)法檢測癌組織及癌旁組織的Beclin1蛋白表達和Ki67增殖指數情況。先使用多聚賴氨酸防脫載玻片貼4 μm石蠟切片，75℃烤片30 min，再將切片脫蠟至水；加入一定量的pH 6.0檸檬酸緩沖液(液面高過切片為度)，加溫至沸騰進行抗原熱修復；冷卻后，將組織切片置于3% H2O2水溶液中15～20 min以阻斷內源性過氧化物酶，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次(1 min/次)；滴加適當稀釋的一抗[Beclin1(1 ∶80)、ki67抗體(即用型)]，37℃孵育90～120 min，4℃過夜后用磷酸鹽緩沖液沖洗3次(3 min/次)；滴加二抗37℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次(5 min/次)；二氨基聯苯胺顯色3～10 min，顯微鏡下監控顯色程度，水洗終止顯色，之后進行蘇木精復染、1%鹽酸酒精分化、飽和碳酸鋰水溶液返藍、梯度酒精脫水、透明，最后封片觀察。

1.4 結果判讀 由兩位主治醫師以上級別病理科醫生獨立閱片。如果兩位醫生閱片結果不一致，則協商確定結果。

1.4.1 Beclin1蛋白：該蛋白主要表達于肺腺癌細胞胞質，陰性細胞呈淡黃色、黃色或棕黃色顆粒。光學顯微鏡下隨機選取5個高倍視野(×400)，每個視野計數100個細胞；根據細胞染色評分和陽性細胞百分比評分乘積判斷Beclin1的表達情況[11]。(1)細胞染色評分。無染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。(2)陽性細胞百分比評分。無陽性細胞為0分，陽性細胞百分比<10%為1分，陽性細胞百分比10%～49%為2分，陽性細胞百分比50%～74%為3分，陽性細胞≥75%為4分。計算細胞染色評分與陽性細胞百分比評分的乘積，乘積≤3分為陰性表達，乘積>3分為陽性表達。

1.4.2 Ki67：Ki67表達于肺腺癌細胞細胞核中，陽性表達為棕黃色。光學顯微鏡下隨機選取5個高倍視野(×400)，每個視野計數100個細胞；細胞無染色為陰性(-)，陽性細胞百分比<10%為弱陽性(1+)，陽性細胞百分比10%～49%為陽性(2+)，陽性細胞數≥50%為強陽性(3+)[12]。

1.5 統計學分析 采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Beclin1蛋白在癌組織及癌旁組織的表達情況 Beclin1蛋白表達于肺腺癌細胞胞質，呈淺黃色至棕黃色顆粒，見圖1。100例癌組織中，Beclin1蛋白陽性79例，陽性表達率為79%；100例癌旁組織中，Beclin1蛋白陽性23例，陽性表達率為23%。癌組織Beclin1陽性表達率高于癌旁組織(χ2=62.745，P<0.001)。

圖1 Beclin1在癌組織及癌旁組織中的表達(SP染色，×400)

2.2 癌組織Beclin1蛋白表達情況與患者臨床病理特征的關系 不同Beclin1蛋白表達情況的患者之間年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移比例及遠處轉移比例比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 癌組織Beclin1蛋白表達情況與患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 癌組織中Beclin1蛋白表達陽性和陰性患者間Ki67表達情況的比較 79例Beclin1蛋白陽性的癌組織中，Ki67強陽性16例，陽性47例，弱陽性或陰性16例；21例Beclin1陰性的癌組織中，Ki67強陽性3例，陽性7例，弱陽性或陰性11例。Beclin1蛋白陽性的癌組織中Ki67表達水平高于Beclin1蛋白陰性的癌組織(z=2.356，P=0.019)。

3 討 論

自噬是真核細胞中細胞初級溶酶體處理內源性底物的分解過程，對于維持細胞內環境穩定和蛋白代謝平衡均有十分重要的作用[6]。研究表明，自噬不僅是細胞自我保護的一種方式，在一定條件下也可誘導細胞凋亡[14]；而與此同時，自噬可抑制凋亡的發生，其通過清除受損細胞器或蛋白，為細胞重新供能，使細胞免于凋亡[6]。Beclin1基因位于人類染色體17q21，主要定位于細胞質結構，如內質網和線粒體[13]。Beclin1是首個被鑒定出來的介導哺乳動物自噬的基因，在細胞自噬的調控中起到關鍵作用；其可招募自噬關鍵蛋白到自噬體前體，與Vps34和ps15形成復合物，參與自噬的早期階段，促進自噬囊泡的成核，并從胞質中吸收蛋白質[15]。因此，Beclin1的異常表達可引起自噬和凋亡分子通路受損，從而導致惡性腫瘤發生[16-17]。

不同的研究中，肺腺癌組織Beclin1蛋白陽性率存在差異：張秀義等[8]報告肺腺癌組織Beclin1蛋白陽性率為30.43%：董桂蘭等[11]報告肺腺癌組織Beclin1蛋白陽性率為51.2%；Wang等[18]報告肺腺癌組織Beclin1蛋白陽性率為46.15%。本研究結果顯示，Beclin1蛋白主要表達于肺腺癌細胞細胞質中，且癌組織Beclin1蛋白陽性表達率為79%，高于癌旁組織(P<0.05)，也明顯高于上述研究結果，與孫雪麗等[19]報告的肺腺癌組織Beclin1蛋白陽性率(86.36%)相近，但與杜海磊等[7]報告的研究結果(肺腺癌癌組織Beclin1蛋白陽性表達率低于癌旁組織)相反。在本研究中，Beclin1蛋白表達情況可能與肺腺癌患者的臨床病理特征(年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移情況及遠處轉移情況)無關，與孫雪麗等[19]的研究結果相似。但相關研究顯示，肺腺癌患者Beclin1蛋白表達情況與其腫瘤分化程度[8，18]、TNM分期[11]、臨床分期[7]、淋巴結轉移情況[7-8，18]、吸煙[18-19]、性別[18]相關。造成這些差異的原因可能與研究樣本量、納入標準、檢測方法、標本固定處理方法不同有關。

Ki67是判斷細胞增殖能力的重要指標，其陽性表達率與腫瘤細胞增殖活躍程度密切相關[9]。因Ki67的半衰期短，臨床上已將其作為評估腫瘤風險的重要指標，用于判斷腫瘤的進展、惡性程度等，具有重要的生物學意義及臨床意義[10]。本研究結果顯示，肺腺癌癌組織Beclin1蛋白陽性患者的Ki67表達水平高于癌組織Beclin1蛋白陰性的患者(P<0.05)，提示Beclin1或可通過促進腫瘤細胞增殖分裂，參與肺腺癌的發生和發展。但因本研究樣本量有限，相關研究結論有待大樣本研究進一步證實。

綜上所述，自噬相關基因Beclin1在肺腺癌組織中高表達，且在Beclin1高表達的肺腺癌組織中Ki67也高表達。由此推測，Beclin1蛋白促進肺腺癌細胞增殖分裂，從而參與肺腺癌的發生和發展，其有望成為判斷肺腺癌惡性程度的生物學指標。