睪丸精子混懸液凍融的臨床結局及不同凍融載體的應用效果▲

李超強 朱凱欣 馮蘭青 蔡 冠 吳亞敏 伍春蓉

(中山大學附屬東華醫院1 生殖醫學科，2 檢驗科，廣東省東莞市 523110， 電子郵箱：donghualcq@126.com)

梗阻性無精子癥患者的睪丸生精功能正常，但由于輸精管道梗阻使其精液中未見精子。部分患者可經藥物或顯微外科吻合術治療后自然生育，部分患者則需卵胞漿內單精子顯微注射技術(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治療才有可能生育。ICSI前需抽取睪丸組織進行組織混懸液或組織病理學檢查，以觀察其內是否有可使用精子[1]。睪丸組織抽取具有創傷性，若能將診斷性抽取到的精子混懸液有效地凍存，用于取卵日授精，可將診斷與治療相互結合，減少對患者不必要的創傷。但睪丸組織精子數量少、活動力差時，常規凍融精子回收率及存活率低[2]。研究表明，影響精子凍融效果的主要因素有精子凍存液、凍融方法及冷凍載體，臨床上精子凍存液已商品化，成分固定，而凍存方法多用手工法[3]，因此冷凍載體成為決定睪丸精子凍融存活率高低的關鍵。近年來，有多項微量載體應用于冷凍睪丸精子的研究報告[4-5]，但未見有關超微量薄片與超微量麥管的應用效果比較。故本研究采用超微量冷凍薄片和超微量冷凍麥管對睪丸診斷性穿刺獲得的精子混懸液進行冷凍，分析睪丸精子混懸液凍融的臨床結局，并比較應用兩種凍融載體的睪丸精子的效果以及胚胎結局，旨在尋找更高效的睪丸精子凍融載體。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2017年1月至2019年7月在我院生殖醫學科因梗阻性無精子癥行ICSI治療的患者共197例。納入標準：符合梗阻性無精子癥的診斷標準。排除標準：女方患有子宮畸形、子宮內膜異位癥、子宮肌瘤、輸卵管積水；女方成熟卵子數<8枚；女方年齡>38歲；女方月經周期不規律，月經第3天血促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)≥10U/L；雙方染色體核型異常。其中43例患者行睪丸精子冷凍ICSI治療(冷凍組)，154例行睪丸新鮮精子ICSI治療(新鮮組)。43例睪丸冷凍精子分為兩等份，分別使用超微量冷凍麥管(麥管組)和超微量冷凍薄片(薄片組)作為載體進行冷凍，將同一患者配偶卵子分為兩組(所獲卵子數為偶數時均分入兩組，為奇數時隨機分組)，分別與復蘇后的麥管組、薄片組精子進行ICSI。所有研究對象均對本研究知情同意，本研究獲得中山大學附屬東華醫院的倫理委員會批準(批件號:2017DHLL037)。

1.2 相關標準

1.2.1 梗阻性無精子癥診斷標準[6]：(1)≥2次精液標本(相隔2周以上)離心前后均未找到精子；(2)睪丸活檢符合梗阻性無精子病理學表現。

1.2.2 精子冷凍條件：睪丸組織混懸液在200倍倒置顯微鏡下每視野發現≥1條活動精子。

1.3 主要試劑和載體 G-IVF PLUS 洗精受精液購自瑞典Vitrolife公司，培養油購自瑞典Vitrolife公司，精子凍存液購自美國Irvine公司，25 μL超微量冷凍薄片載體購自上海辛菖醫療器械有限公司，50 μL超微量冷凍麥管購自上海郜鴻生物科技有限公司。

1.4 治療方法

1.4.1 睪丸診斷性穿刺：患者取截石位，常規消毒、鋪巾，采用2%利多卡因局部麻醉后，用10 mL無菌注射器緩慢刺入睪丸，緩慢回抽，注射器內吸入少量曲細精管后迅速撤針，將穿刺獲得的睪丸組織分為兩等份，其中一份送病理檢查，另一份置于裝有3 mL G-IVF PLUS 洗精受精液的培養皿內，立即送至胚胎培養室進行處理。

1.4.2 睪丸精子冷凍

1.4.2.1 睪丸精子冷凍前處理：將穿刺抽取到的睪丸生精小管組織用G-IVF PLUS 洗精受精液洗滌3次后，放入盛有50 μL G-IVF PLUS 洗精受精液的平皿中，室溫下用2支無菌1 mL BD注射器針頭快速撕碎生精小管，鏡檢精子情況，若符合冷凍標準，把精子混懸液吸入離心管中，然后加G-IVF PLUS 洗精受精液至1 mL。37℃、6%CO2孵育3 h后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，留沉淀0.03 mL，加入0.02 mL精子凍存液混勻，平均成兩份，在200倍倒置鏡下迅速計數薄片載體10個視野活動精子數。

1.4.2.2 不同載體睪丸精子凍融：(1)超微量冷凍麥管凍融。用1 mL注射器接上麥管口，麥管尖端置于睪丸精子混懸液中，吸入混懸液后去掉注射器后封住麥管兩端，依照臨床診療指南的操作規程[3]進行麥管冷凍。取卵日取出凍存麥管，用紗布擦去麥管上冰霜后迅速置于37℃水浴箱中復溫30 s；取出麥管用無菌紗布擦去麥管表面水珠，用無菌剪刀剪開麥管尖端，管口接上1 mL注射器，把麥管中混懸液推注于顯微穿刺皿的圓圈內，蓋上37℃培養油孵育30 min，在200倍倒置鏡下計數10個視野活動精子數。(2)超微量冷凍薄片凍融：將混懸液平鋪于冷凍薄片的冷凍圈上，依照臨床診療指南的操作規程[3]進行薄片冷凍。取卵日取出冷凍薄片，立即插入盛有37℃培養油的顯微穿刺皿中孵育30 min，在200倍倒置鏡下計數10個視野活動精子數。

1.4.3 睪丸新鮮精子行ICSI前處理：取卵日時男方進行睪丸穿刺取精，將抽取到的生精小管用G-IVF PLUS 洗精受精液洗滌3次后，放入盛有50 μL G-IVF PLUS 洗精受精液的平皿中，室溫下用2支無菌1 mL BD注射器針頭快速撕碎，將精子混懸液吸入15 mL離心管中加G-IVF PLUS 洗精受精液至1 mL，37℃、6%CO2孵育3 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，留沉淀0.03 mL備用。

1.4.4 促排卵方案：采用標準黃體期長效長方案，黃體中期皮下注射注射用醋酸曲普瑞林(法國益普生公司，3.75 mg/安瓿)進行降調，使用劑量根據患者體重、年齡、竇卵泡數目、基礎性激素水平及既往治療周期用藥情況制定。達到降調標準后，給予150 IU/d注射用重組人FSH(果納芬，瑞士雪蘭諾公司)皮下注射和75 IU/d注射用尿促性素(珠海麗珠制藥)肌肉注射進行促排卵。降調標準:月經來潮第3～5 d，B超監測子宮內膜厚度≤5 mm，所有卵泡直徑≤5 mm，血雌二醇<50 pg/mL，FSH<5 IU/L、黃體生成素<5 IU/L；直徑≥4 mm的竇卵泡數占總竇卵泡數的60%以上。當患者優勢卵泡直徑≥18 mm時，當晚肌內注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)10 000U(珠海麗珠制藥)，34～36 h后在陰道B超引導下穿刺取卵術，于體視鏡下收集卵子。

1.4.5 ICSI授精及胚胎評分：hCG注射后39～40 h去除卵子顆粒細胞，依據研究分組分別用新鮮精子、兩種載體凍融復蘇的存活精子進行ICSI。ICSI后(17±1)h(D1)卵子有雙原核為正常受精，受精后(44±1)h(D2)、(68±1)h(D3)進行胚胎評分。參照《人類體外受精-胚胎移植實驗室操作專家共識(2016)》，根據卵裂球數目、卵裂球均勻程度和碎片率等進行卵裂期胚胎評分，優質卵裂期胚胎評定標準為D1為雙原核，D2卵裂球無多核，D3卵裂球數為7～9個，大小較均勻，形狀規則，碎片≤20%；按Gardner囊胚分級法進行囊胚期胚胎評分，即根據囊胚發育階段、內細胞團和滋養層細胞的綜合情況來評定，囊胚發育分為6個時期(1～6期)，對于3～6期的囊胚，還需對其內細胞團細胞和滋養層細胞進行A、B、C 3個級別的分級。

1.4.6 移植及妊娠判定：移植胚胎來源不區分麥管載體還是薄片載體，數量≤3枚。胚胎移植5周后B超下檢查孕囊，有孕囊為臨床妊娠。

1.5 觀察指標 (1)記錄冷凍組和新鮮組獲卵數、成熟卵子率、移植胚胎數、受精情況(正常受精率和優質胚胎率)、妊娠結局(種植率、周期臨床妊娠率和流產率)，冷凍組的結果為麥管組與薄片組的合并數據。其中，正常受精率=正常受精卵數/注射MⅡ卵數×100%，優質胚胎率=優質卵裂期胚胎數/正常受精卵數×100%，種植率=宮內及宮外孕囊總數/移植胚胎數×100%，周期臨床妊娠率=周期臨床妊娠數/周期數×100%，流產率=早期流產周期數/周期臨床妊娠數×100%。(2)比較麥管組、薄片組活動精子回收率、正常受精率、卵裂率、胚胎利用率和優質胚胎率。其中，活動精子回收率=復蘇后活動精子數/冷凍前活動精子數×100%，卵裂率=受精卵裂數/正常受精卵數×100%，胚胎利用率=(雙原核冷凍胚胎數+雙原核移植胚胎數)/正常受精卵數×100%。

1.6 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 冷凍組和新鮮組一般資料的比較 兩組男方年齡、兩組女方年齡、體質指數、不孕年限、基礎激素水平、hCG日激素水平及內膜厚度、促性腺激素(gonadotropin，Gn)使用天數和總量相比，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 新鮮組與冷凍組一般資料的比較(x±s)

2.2 冷凍組和新鮮組受精情況及妊娠結局的比較 兩組成熟卵子率、正常受精率、優質胚胎率、種植率、周期臨床妊娠率和流產率相比，差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表2。

2.3 兩種不同凍融載體的睪丸精子凍融效果和胚胎結局的比較 冷凍組冷凍前活動精子數為(10.74±2.59)個，兩種載體冷凍復蘇后均能找到活動精子，并滿足卵子受精使用，麥管組、薄片組活動精子數分別為(4.16±1.27)個、(5.12±1.53)個。麥管組活動精子回收率低于薄片組(P<0.05)，但兩組的正常受精率、卵裂率、胚胎利用率和優質胚胎率差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 兩種不同凍融載體的睪丸精子凍融效果和胚胎結局的比較

3 討 論

2015年，我國ICSI的臨床妊娠率約為50.0%[7]。在無精子癥患者的睪丸或附睪中找到活動精子是ICSI 治療的關鍵。研究顯示，不同人群經皮睪丸精子抽吸術一次性活檢能找到精子的概率存在差異：在梗阻性無精子癥患者中約為86.0%，而在非梗阻性無精子癥患者中約為29.5%[8]。故梗阻性無精子癥患者行ICSI治療時也面臨反復睪丸穿刺取精的可能，或妊娠失敗后還需進行多次睪丸穿刺取精。所以，簡單、安全地冷凍睪丸診斷性檢查穿刺獲得的精子或ICSI治療剩余的精子，其復蘇后的活動率高、受精率正常、胚胎質量及妊娠結局好，成為精子高效凍融的目標與研究方向。

精子凍融會改變精子形態、精子質膜以及增加DNA損傷[9]，關于睪丸冷凍精子的受精能力，各研究的結果不盡相同。Roque等[10]研究發現，凍融睪丸精子受精率為67.9%；Sun等[5]研究發現，非梗阻性無精子癥患者凍融睪丸精子受精率為73.0%，卵裂率為86.0%；Yu等[11]的研究結果顯示，睪丸新鮮精子與睪丸冷凍精子受精率分別為73.4%、71.4%，優質胚胎率分別為54.5%、55.3%，囊胚形成率分別為60.1%、60.9%，各指標差異均無統計學意義(均P>0.05)。本研究中，睪丸冷凍精子的正常受精率和優質胚胎率分別為80.21%、40.09%，而睪丸新鮮精子為79.04%、40.23%，兩者的受精能力和胚胎質量相似(P>0.05)。睪丸精子由于缺少輸精管及精漿作用而成熟度差，經過凍融的不良因素的作用后，胚胎后期發育及種植能力尚無統一定論。有文獻顯示，睪丸凍融精子形成的胚胎種植能力降低、流產風險增加[12]；但也有研究表明睪丸冷凍精子與睪丸新鮮精子的妊娠結局相似[13-14]。本研究中，睪丸冷凍精子和新鮮精子的受精情況及妊娠結局差異無統計學意義(均P>0.05)，但睪丸冷凍精子的種植率和周期臨床妊娠率稍低于睪丸新鮮精子，而流產率稍高于新鮮精子。由于本研究冷凍組的例數僅為43例，樣本量小，且并未能區分不同載體進行分析，所得結果可能存在偏倚，睪丸凍融精子的妊娠結局是否與睪丸新鮮精子存在差異，仍需多中心大數據研究進一步論證。

目前臨床上的睪丸精子凍融載體有微量麥管、微量薄片、冷凍麥管、冷凍環和ICSI針管等，采用合適的冷凍載體行精子凍融后活動精子回收率高，對于成熟卵子數多的病例以及縮短ICSI體外操作時間非常有利。研究表明，薄片類載體凍融操作簡單，且能獲得較高的精子回收率及存活率。Sun等[5]使用新型薄片載體冷凍睪丸精子，精子回收率為83.0%，活動率為47.5%；Coetzee等[15]使用Cell Sleeper薄片類載體冷凍睪丸精子，存活率約為58.8%。此外，也有學者認為，微量麥管也能獲得較高的精子回收率及存活率。王乃輝等[16]使用超微量冷凍麥管冷凍睪丸精子，精子復蘇率為86.96%，活動率為40.2%；Liu等[17]使用微量麥管凍融微量精子，其活動率為38.5%。本研究使用超微量冷凍麥管和超微量冷凍薄片分別冷凍診斷性睪丸精子混懸液，解凍后兩載體的活動精子均能滿足受精所需，薄片組活動精子回收率為47.62%，麥管組為38.74%，與其他研究報告的結果相似[5,16]。本研究挑選復蘇后形態正常且活力好的精子分別行ICSI，兩組的正常受精率、卵裂率及優質胚胎率差異均無統計學意義(均P>0.05)，即兩載體有相似的受精率及胚胎質量；但薄片組活動精子回收率優于麥管組(P<0.05)，由此可見，同等胚胎結局下超微量冷凍薄片在提高睪丸精子凍融后活動率方面具有優勢。精子凍融過程是一個篩選過程，只有活力好、頂體膜功能穩定的精子才能經受住低溫作用而得以存活，且復蘇精子的活動力與精子DNA碎片升高率呈負相關[18]。薄片載體采用原位冷凍解凍，混懸液不需要移位，減少因操作原因導致的精子丟失；同時冷凍的精子混懸液平鋪于薄片載體，增加了凍融表面積，提高了凍融溫度變化速率，減少精子凍融損傷。

綜上所述， 采用睪丸冷凍精子與睪丸新鮮精子行ICSI有相似的臨床結局，其中使用超微量冷凍薄片對睪丸精子混懸液進行凍融可獲得較好的效果。睪丸精子雖然具有受精及卵裂所需的中心粒及相關因子，但缺乏精子正常成熟過程，睪丸精子凍融的遠期安全性仍需長期地隨訪研究。