雷公藤紅素對前脂肪細胞3T3-L1 成脂分化的抑制作用及其機制

劉旭，楊勝榮，王希敏

天津市南開醫院，天津300010

2 型糖尿病（T2DM）發病率呈逐年升高趨勢，我國目前有超過1 億的成年糖尿病患者［1］。90% 以上的T2DM 患者均存在胰島素抵抗（IR），同時伴或不伴有胰島素相對分泌不足。發生IR的T2DM患者體內正常胰島素濃度的生物學效應低于正常，究其原因是胰島素靶組織對胰島素的敏感性和反應性降低。臨床治療糖尿病大多立足于改善胰島素敏感性。肥胖是IR 發生的最主要因素［2］。CCAAT/增強子結合蛋白α（C/EBPα）、過氧化物酶體增殖物激活受體g2（PPARg2）和脂肪酸蛋白4（FABP4）是脂肪生成相關蛋白，這些蛋白表達增加可以明顯增強脂肪細胞的成脂分化。在脂肪細胞中，胰島素通過磷酸化胰島素受體來激活胰島素受體底物（IRS），磷酸化的IRS 結合磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的調節亞基p85，進而激活催化亞基p110 來活化絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）信號通路，刺激葡萄糖轉運蛋白4 從細胞質轉位至細胞膜，促進各個組織的葡萄糖攝取及利用［3-4］。雷公藤紅素來源于中藥雷公藤根皮，是一種具有多種天然活性的醌甲基三萜，是雷公藤片和雷公藤多苷片等制劑的有效成分之一。雷公藤紅素已用于多種疾病的治療，其藥理作用除了抗炎、抗腫瘤外，還有抗糖尿病和肥胖的作用［5-11］。在高脂飲食誘導的肥胖鼠模型中，雷公藤紅素能夠減少鼠進食量，增加能量消耗，發揮強效減輕體質量效果。但雷公藤紅素與脂肪分化之間的關系尚未見報道。2018年10月—2019年11月，本研究以前脂肪細胞3T3-L1為模型，觀察了雷公藤紅素對成脂分化的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 前脂肪細胞3T3-L1 接種于含10% FBS、200 U/mL 青霉素、200 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養基中，放于37 ℃、5% CO2加濕培養箱中培養。雷公藤紅素購自上海詩丹德生物公司，純度＞98%。FBS 和DMEM 培養基購自美國HyClone公司。CCK-8 試劑盒購自碧云天生物技術研究所。TRIzol 購自美國Invitrogen 公司。逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒購于北京全式金生物公司。PCR引物購自北京擎科新業生物技術有限公司。C/EBPα 抗體、FABP4 抗體、PPARg2 抗體、PTPN11 抗體均購于美國Proteintech 公司。HRP 標記的羊抗兔二抗購自三箭生物技術公司。

1.2 3T3-L1 細胞成脂分化誘導及雷公藤紅素作用濃度篩選 1.2.1 成脂分化誘導 在37 ℃、5% CO2的濕潤環境中，3T3-L1 細胞在脂肪細胞誘導培養基（含10%FBS、0.5 μmol/L 地塞米松、0.25 mmol/L 甲基異丁基黃嘌呤、5 μg/mL胰島素和50 μmol/L吲哚美辛的α-MEM培養基）中培養3 d達到約90%融合。

1.2.2 雷公藤紅素作用濃度篩選 雷公藤紅素用DMSO 配置成50 mmol/L 備用。將3T3-L1 細胞以3×103/孔接種到96 孔板中，在脂肪細胞誘導培養基中培養，分別給予0、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L 的雷公藤紅素于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養48 h。將CCK-8試劑添加到每個孔中，37 ℃下培養2 h。用多功能酶標儀于450 nm 波長處檢測吸光度值。小劑量雷公藤紅素對細胞增殖能力無明顯影響，0.3μmol/L 以上劑量的雷公藤紅素作用后細胞增殖能力明顯減弱。選擇0.3 μmol/L劑量用于后續實驗。

1.3 雷公藤紅素作用后3T3-L1細胞中脂質檢測 3T3-L1 細胞在脂肪細胞誘導培養基中培養達到90% 融合后，分別給予0、0.3 μmol/L 的雷公藤紅素處理3 d。用冷PBS 將處理過的細胞輕輕清洗2 次，在室溫下于4%多聚甲醛中固定10 min。隨后，細胞用去離子水洗滌2 次，并在室溫下用60% 飽和油紅O 染色5 min。每孔加入4% 異丙醇，在振動搖床上搖動15 min，520 nm 波長下測定提取染料光吸收率反映細胞內油紅O含量。

1.4 雷公藤紅素作用的3T3-L1 細胞中脂肪生成相關基因檢測 3T3-L1 細胞培養及處理方法同“1.3”。用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，然后用逆轉錄試劑盒將每個樣本的RNA 1 μg 逆轉錄成cD?NA，逆轉錄條件為25 ℃10 min，37 ℃1 h，85 ℃2 min。應用SGExcel Fast SYBR Mixture kits 進行qP?CR 檢測。95 ℃預變性2 min，95 ℃10 s、60 ℃10 s、72 ℃10 s，共40 個循環。以β-tubulin 為內參。C/EBPα 上游引物序列為5′-CTGATTCTTGCCAAACT?GAG-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-GAGGAAGCTA?AGACCCACTAC-3′；PPARγ上游引物序列為5′-CTT?GACAGGAAAGACAACGG-3′，下游引物序列為5′-GCTTCTACGGATCGAAACTG-3′；FABP4上游引物序列為5′-AAATCACCGCAGACGACAGG-3′，下游引物序 列 為5′-GGCTCATGCCCTTTCATAAAC-3′。 以2－ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.5 雷公藤紅素作用的3T3-L1 細胞中脂肪生成相關蛋白檢測 3T3-L1 細胞培養及處理方法同“1.3”。處理后的細胞用RIPA 裂解液裂解，應用BCA 蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。每組取20 μg蛋白樣本行12% SDS-PAGE 電泳，PVDF轉膜；5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入一抗tubulin 抗體（1∶2 000）、C/EBPα 抗體（1∶1 000）、FABP4 抗體（1∶1 000）、PPARγ 抗體（1∶1 000）于4 ℃孵育過夜；PBST 洗膜后，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，PBST 洗膜后用ECL 化學發光法染色；Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.6 雷公藤紅素作用靶點預測及驗證 利用在線藥物靶點預測軟件Swiss Target Predication 分析雷公藤紅素的潛在作用靶點。3T3-L1 細胞培養及處理方法同“1.3”。分別采用RT-PCR 法和Western blot?ting法檢測預測靶點基因和蛋白表達。

1.7 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 或Dunnett 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤紅素作用的3T3-L1 細胞中脂質積累情況 0、0.3 μmol/L的雷公藤紅素處理3 d后，3T3-L1細胞中脂質累積分別為97.33% ± 1.45%、33.33%± 3.48%，雷公藤紅素處理后細胞中脂質累積減少（P均＜0.01）。見圖1。

圖1 不同濃度雷公藤紅素作用的3T3-L1細胞中脂質積累情況

2.2 雷公藤紅素對3T3-L1 細胞脂肪生成相關基因及蛋白表達的影響 0.3 μmol/L 雷公藤紅素作用后，3T3-L1 細胞中C/EBPα、PPARg2、FABP4 mRNA及蛋白相對表達量均降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度雷公藤紅素作用后3T3-L1細胞脂肪生成相關基因及蛋白表達比較（）

表1 不同濃度雷公藤紅素作用后3T3-L1細胞脂肪生成相關基因及蛋白表達比較（）

注：與0 μmol/L組相比，*P＜0.05。

濃度0 μmol/L 0.3 μmol/L C/EBPα mRNA 1.229 ± 0.229 0.175 ± 0.071*蛋白1.107 ± 0.056 0.432 ± 0.028*蛋白1.145 ± 0.022 0.239 ± 0.071*PPARg2 mRNA 1.151 ± 0.115 0.299 ± 0.035*蛋白1.054 ± 0.026 0.591 ± 0.030*FABP4 mRNA 0.887 ± 0.113 0.151 ± 0.063*

2.3 雷公藤紅素藥物作用靶點預測及驗證情況雷公藤紅素藥物作用靶點主要與酶（20.0%）、核受體（20.0%）、磷酸酶（13.3%）、TLR-1 和IL-1 受體（6.7%）、細胞色素P450（6.7%）等相關。在預測出的30 多種雷公藤紅素可能藥物靶點中，PTPN11 排名位于前列，提示PTPN11 很可能是雷公藤紅素的作用靶點。實驗結果顯示，0、0.3 μmol/L 雷公藤紅素處理的3T3-L1 細胞中PTPN11 mRNA 相對表達量分別為1.079 ± 0.079、0.375 ± 0.029，PTPN11 蛋白相對表達量分別為1.128 ± 0.064、0.669 ± 0.084。雷公藤紅素作用于3T3-L1 細胞后，PTPN11 mRNA及蛋白表達均下調（P均＜0.05）。

3 討論

雷公藤紅素作為一種傳統中藥，也已被用于糖尿病和肥胖的治療［15］。文獻報道，雷公藤紅素可通過抑制NF-κB信號通路激活來減少前脂肪細胞3T3-L1 中活性氧生成，提高線粒體膜電位［16-17］。雷公藤紅素可通過激活PI3K/Akt 通路來增加胰島素信號通路活性［18］。雷公藤紅素還有助于增加高脂膳食誘導的肥胖小鼠對瘦素的敏感性。還有研究認為，雷公藤紅素能夠減少攝食量、增加能量消耗，從而發揮強效減重作用［15］。胰島β 細胞功能障礙是T2DM 決定性的發病因素。雷公藤紅素可以直接作用于胰島β 細胞，抑制胰島β 細胞凋亡［19］。但是，雷公藤紅素對成脂分化的調控作用尚未見研究報道。本研究觀察了雷公藤紅素對前脂肪細胞3T3-L1 成脂分化的影響，并探討相關機制，進一步探索雷公藤紅素在糖尿病治療中的潛在價值。

脂肪細胞的特征表現之一是脂滴形成。細胞內脂滴大小和數量是評價細胞成脂分化程度的量化指標。本研究油紅O 染色結果顯示，經不同濃度雷公藤紅素作用的3T3-L1 細胞胞質著色比較深，脂滴體積較大，脂滴數目較多，表明各組細胞都出現了成脂分化現象，但雷公藤紅素作用組成脂分化能力受到抑制，且抑制程度與雷公藤紅素作用濃度相關。這表明，雷公藤紅素能夠抑制前脂肪細胞的成脂分化。

PPARg2 和C/EBPα 是脂肪細胞分化的兩種關鍵轉錄因子。其中PPARg 屬于核受體超家族成員，是在成脂分化過程中起核心調控作用的特異性轉錄因子，通過調控C/EBPalpha、FABP4 表達來調節脂肪細胞分化速度和脂滴形成［12］。FABP4 是成熟脂肪細胞胞質蛋白，是反映成脂分化能力的關鍵指標之一［13-14］。本研究結果顯示，0.3 μmol/L 雷公藤紅素作用后，3T3-L1 細胞中C/EBPα、PPARg2、FABP4 mRNA 及蛋白相對表達量均降低，進一步表明未經雷公藤紅素處理的細胞成脂分化能力最高，而雷公藤紅素作用降低了前脂肪細胞的成脂分化能力。

本研究利用在線藥物靶點預測軟件Swiss Tar?get Predication 分析雷公藤紅素的潛在作用靶點，結果顯示，雷公藤紅素藥物作用靶點主要與酶、核受體、磷酸酶、TLR-1 和IL-1 受體、細胞色素P450 等相關，PTPN11 可能是雷公藤紅素的潛在作用靶點，且雷公藤紅素可在mRNA 和蛋白水平降低PTPN11 的表達。研究表明，脂肪組織通過分泌包括瘦素在內的多種脂肪因子來調節細胞能量代謝及生理活動［20］。瘦素是目前研究較為廣泛的脂肪因子，其可誘導STAT3 磷酸化并轉位至細胞核中，使瘦素靶基因轉錄，完成瘦素的信號轉導。PTPN11基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP-2），后者參與胞外刺激信號傳入胞內的過程，調控Ras/Raf/MAPK、JAK/STAT、ERK 及PI3K 等多種信號轉導通路的活化。除了SHP-2廣為人知的對腫瘤的調節作用外，SHP-2亦調控肥胖發生。SHP-2可調節瘦素的表達水平，SHP-2基因敲除小鼠的后代即使正常飲食也會比野生型小鼠易于出現早期肥胖。結合文獻報道及本研究中雷公藤紅素抑制3T3-L1 細胞成脂分化的結果，推測PTPN11 基因編碼的SHP-2 很有可能是雷公藤紅素抗成脂分化作用的靶點。

綜上所述，雷公藤紅素可抑制前脂肪細胞3T3-L1 成脂分化，其機制與下調PTPN11 表達、抑制脂肪生成相關蛋白信號通路有關，上述研究結果仍需后續實驗進一步證實。