亞麻響應低鉀脅迫轉錄譜分析

黃文功 姜衛東 姚玉波 宋喜霞 劉 巖 陳 思 趙東升 吳廣文 袁紅梅 任傳英 孫中義 吳建忠 康慶華,*

專題

亞麻響應低鉀脅迫轉錄譜分析

黃文功1姜衛東1姚玉波1宋喜霞1劉 巖1陳 思1趙東升1吳廣文1袁紅梅1任傳英2孫中義3吳建忠4康慶華1,*

1黑龍江省農業科學院經濟作物研究所, 黑龍江哈爾濱 150086;2黑龍江省農業科學院食品加工研究所, 黑龍江哈爾濱 150086;3黑龍江省農業科學院畜牧研究所, 黑龍江哈爾濱 150086;4黑龍江省農業科學院草業研究所, 黑龍江哈爾濱 150086

鉀是亞麻生長發育必需的大量元素。本研究以鉀高效利用亞麻品種Sofie為試驗材料, 在低鉀處理12 h和96 h下, 利用轉錄組測序及qRT-PCR進行低鉀脅迫下差異基因表達調控的研究。結果表明, 低鉀處理7 d的亞麻葉片邊緣變黃, 與對照相比, 低鉀處理植株矮化。篩選出對低鉀響應強烈的3個鉀運轉蛋白基因(Lus K channel 1)、(Lus STELAR K+outward rectifier)和(Lus high affinity K+transporter 5), 低鉀脅迫響應峰值時間為12 h和96 h; 與對照相比, 低鉀處理12 h鑒定到差異表達基因1154個(508個上調, 646個下調), GO功能富集分析表明, 這些差異表達基因主要富集于代謝過程、細胞進程、單一生物過程、催化活性和結合功能五大類, KEGG通路富集分析表明, 這些差異表達基因涉及到能量代謝、碳水化合物代謝、碳代謝、氨基酸代謝、萜類化合物代謝和植物激素信號轉導等通路。進而篩選出7個與鉀直接相關基因(4個鉀運輸蛋白、2個鉀通道蛋白及1個鈉鉀鈣交換蛋白)、13個與激素相關基因以及6個與纖維素合成相關基因。7個與鉀直接相關基因中, 2個基因表達量上調1.75倍和2.64倍, 5個基因表達量下調1.21~9.57倍。以上解析的差異基因初步揭示了亞麻低鉀涉及的轉錄調控途徑, 可為亞麻耐低鉀相關基因的克隆與功能驗證奠定基礎。

亞麻; 低鉀; 轉錄組; 差異表達基因

中國耕地土壤鉀含量普遍低, 以土壤中速效鉀含量70 mg kg-1為標準, 中國低鉀土壤總面積約2.27×108hm2[1], 嚴重制約了作物的正常生長發育。中國鉀肥施用量從2011年的6.05′109kg增加到2017年的1.95′1010kg[2-3]。大量施用鉀肥, 不僅增加生產成本、加速鉀資源枯竭, 并造成環境污染問題。研究表明, 不同物種甚至同一作物不同品種在土壤鉀素利用上表現出顯著差異[4]。最近, 轉基因等方法被用來提高鉀吸收和利用效率[5]。這些措施將緩解鉀素資源的進一步枯竭, 并提高作物產量和品質。亞麻(L.)是一種廣泛種植的經濟作物, 有悠久的栽培歷史。鉀是亞麻生長發育必需的大量元素。對亞麻鉀吸收和利用進行科學研究, 提高亞麻對低鉀脅迫適應性, 對于中國農業化肥實現“雙減”, 保護環境, 避免過量施用化肥造成的環境污染, 實現綠水青山理念, 實現中國生態農業綠色可持續發展有重要意義。

鉀是植物生長的必需元素, 是植物體內含量最高的陽離子, 占植物干物質總量2%~10%, 在生長發育中起重要作用[6-8]。植物中的鉀調節許多物理過程包括植株生長、產量和品質參數[9]。鉀參與光合作用及葉綠素合成, 鉀是植物體中重要的滲透調節物質。K+遷移對低鉀土壤中的植物生長至關重要, 已發現許多鉀通道, 如KT/KUP/HAK轉運蛋白家族[10-12]和KCOs家族[13]。還發現其他具有雙重功能的轉運體, 包括具有Na+和K+轉運體雙重功能的HKT轉運體[14]和CBL-CIPK, 后者受Ca2+信號通路調節, 并激活AKT1通道[15-17]。此外, ROS信號通路中的RCI3/RAP被認為激活轉運體HAK。植物低鉀表現明顯癥狀為莖弱、容易倒伏、葉片失水、耐旱性和耐寒性降低、蛋白質和葉綠素分解、葉片變黃最終組織壞死[18]。

目前已發表的亞麻基因組序列圖[19]極大地促進了亞麻的研究。亞麻的簡化基因組測序結果表明, 遺傳圖譜總長度為1483.25 cM, 2339個標記均勻分布于15個連鎖群, 分別對應于亞麻15條染色體, 相鄰標記間平均距離為0.63 cM, 該圖譜是目前為止密度最高的亞麻全基因組遺傳連鎖圖譜[20]。有學者提出一種涉及激活蛋白的低鉀反應機制的存在[21]。目前亞麻對低鉀脅迫的分子機制及參與這一調控過程的基因仍不明晰。特定響應基因表達的變化決定了鉀脅迫下亞麻形態及生理變化, 差異基因表達研究有利于揭示鉀脅迫下亞麻內在的分子響應機制, 為分子輔助品種選育奠定基礎。本研究以亞麻品種Sofie為研究材料, 深入挖掘低鉀脅迫下Sofie中的差異表達基因, 通過揭示鉀脅迫相關的分子及信號通路, 以期為亞麻耐低鉀相關基因的克隆與功能驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

鉀高效利用亞麻品種Sofie由國家麻類種質改良中心亞麻分中心提供。

1.2 生長條件及脅迫處理

將Sofie種子播種于裝有蛭石(已經過121℃濕熱滅菌20 min)的紙杯中, 紙杯置于塑料托盤上, 每個托盤澆等體積水, 每個紙杯播種30粒種子。出苗至脅迫處理前每3天澆1/2 MS, 將播種后的亞麻置于相對濕度70%的植物培養箱中, 23℃, 16 h光照/18℃, 8 h黑暗。設MS培養基中的K+濃度(20 mmol L-1)和0 (0 mmol L-1) 2個鉀處理梯度。

在Sofie生長至3對真葉時(出苗后7 d)進行2種濃度的鉀處理, 每個組培瓶中放置10株均勻一致的亞麻植株, 每個組培瓶200 mL培養液, 處理重復3次。每3 d更換1次培養液, 直至出現低鉀癥狀(葉片邊緣變黃)為止。

生長一致的3周Sofie幼苗正常澆MS培養液(充足的K+供應, 含KCl)作為低鉀對照(CK), 澆低鉀培養液(無KCl)的作為低鉀處理(KS)。CK營養液是改變的MS培養液, KCl代替KNO3。CK和KS脅迫12 h和96 h, 整株苗取樣, 液氮凍后-80℃貯存, 供RNA提取用于后續測序分析。

1.3 qRT-PCR引物

根據擬南芥中的鉀運轉蛋白相關基因, 在網站(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmL)設計亞麻、、、、、、、、共9個基因的引物, 每個基因設計3對引物。

1.4 轉錄組測序

采用TIANGEN RNA prep pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA。用TIANGEN Tgem Spectrophotometen檢測所提取RNA A260/A280比值及濃度。CK和KS處理12 h和96 h提取的Sofie整株植株RNA (3次重復)分別命名為12h-CK-1、12h-CK-2、12h-CK-3、12h-KS-1、12h-KS-2、12h-KS-3、96h-CK-1、96h-CK-2、96h-CK-3、96h-KS-1、96h-KS-2和96h-KS-3。總RNA的質量和數量分析、建庫及Illumina測序由華大基因公司(BGI, Shenzhen, China)完成。RNA-seq相應數據(編號: SRP120129)上傳至公共數據庫NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.5 qRT-PCR分析

按上述方法提取總RNA。TIANGEN RNAprep pure Plant Kit已含有去基因組DNA試劑, 逆轉錄時省去該步驟。逆轉錄方法采用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (Code No. FSQ-301)。RNA的變性: 將RNA 65℃ 5 min, 立即冰上冷卻。逆轉錄反應體系為10 μL, 包含RNA template 0.5 pg~0.5 μg、Nuclease-free Water、5×RT Master Mix II。輕輕攪拌反應溶液, 以下溫度進行反應: 37℃ 15 min, 50℃ 5 min, 98℃ 5 min, 4℃保存。

將1 μg總RNA合成第1鏈cDNA。PCR反應體系為95℃ 3 min; 95℃ 5 s, 60℃ 40 s, 72℃ 10 s, 45個循環。為驗證引物特異性, 45個循環后進行溶解曲線繪制。qRT-PCR試驗設置3次生物學重復。qRT-PCR試驗內參基因為。利用2?ΔΔCt計算基因相對表達量。利用Primer 3 (http://frodo.wi.mit. edu/primer3)設計引物。

1.6 統計分析

所有試驗3次重復, 數據用平均值±標準差(SD)表示。采用SPSS 17.0軟件分析數據, 各組間比較采用單因素方差分析。<0.05的值為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 亞麻低鉀脅迫響應時間的確定

2.1.1 亞麻低鉀脅迫處理前后亞麻表型 Sofie出苗7 d, 在蛭石中的生長狀態及各植株生長情況見圖1-A。由圖1-B可看出, 各植株生長一致, 長勢良好。處理時, 對照和處理的生長狀態見圖1-C。處理7 d, 低鉀和對照的生長狀態見圖1-D和E。說明低鉀處理7 d植株出現葉片邊緣變黃癥狀, 與對照相比, 低鉀處理植株矮化。

2.1.2 亞麻低鉀脅迫標記基因篩選 以低鉀處理48 h K0的cDNA稀釋10倍為模板進行PCR, 篩選標記基因引物及內參。從圖2-A~C可看出, 引物LusKC1-1、LusSKOR-1、LusHAK5-2、LusKEA5-2和LusActin特異性好。本試驗從4個特異性好的標記基因引物LusKC1-1、LusSKOR-1、LusHAK5-2和LusKEA5-2中選取3個標記基因、、及內參進行qRT-PCR試驗。

A: 蛭石中生長; B: 處理前的植株表型; C: 低鉀脅迫對照和處理的生長狀態; D: 處理后低鉀和對照的植株表型; E: 處理后低鉀和對照的單株表型。a: 低鉀脅迫的植株表型; b: 對照的植株表型。

A: growth in vermiculite; B: plant phenotype before treatment; C: growth condition of control and treatment under low-K+stress; D: plant phenotypes of low-K+and control plants after treatment; E: single plant phenotype of low-K+and control after treatment. a: plant phenotype under low-K+; b: plant phenotype of control.

M: DL2000; 1: LusKC1-1; 2: LusKC1-2; 3: LusKC1-3; 4: LusSKOR-1; 5: LusSKOR-2; 6: LusSKOR-3; 7: LusAKT2-1; 8: LusAKT2-2; 9: LusAKT2-3; 10: LusHAK5-1; 11: LusHAK5-2; 12: LusHAK5-3; 13: LusKUP2-1; 14: LusKUP2-2; 15: LusKUP2-3; 16: LusKUP3-1; 17: LusKUP3-2; 18: LusKUP3-3; 19: LusKUP12-1; 20: LusKUP12-2; 21: LusKUP12-3; 22: LusKEA5-1; 23: LusKEA5-2; 24: LusKEA5-3; 25: LusCHX17-1; 26: LusCHX17-2; 27: LusCHX17-3; 28: LusEF1A; 29: LusUBI; 30: LusTUA; 31: LusEF2; 32: LusActin.

2.1.3 亞麻低鉀脅迫響應時間篩選 在低鉀脅迫6 h、12 h、24 h、48 h、96 h、192 h、10 d和15 d時, 利用篩出的標記基因引物LusKC1-1、LusSKOR-1、LusHAK5-2及內參引物進行qRT-PCR試驗。從圖3可看出,在12 h和96 h表達量顯著高于其他時間(<0.05);在12 h和96 h表達量高, 這2個時間表達量顯著高于其他時間(<0.05);在12 h和96 h表達量顯著高于其他時間(<0.05)。綜合3個標記基因、和qRT-PCR表達情況發現, 3個標記基因12 h開始高表達, 96 h表達處于另一個高峰。選取低鉀處理及對照在12 h和96 h取樣, 進行后續轉錄組測序。

同一基因中不同小寫字母分別表示在0.05水平差異顯著。

Different lowercase letters mean significant differences at the 0.05 probability level during the same gene.

2.2 亞麻低鉀的RNA-seq

2.2.1 亞麻低鉀轉錄組測序統計分析 利用低鉀12 h和96 h Sofie及對應時間對照樣品總RNA構建Illumina測序文庫。每個文庫平均得到38.07 Mb原始測序讀數, 其中95.38%以上為過濾讀數。將過濾讀數與亞麻基因組序列比對, 至少86.17%讀數成功與數據庫參考基因組序列比對上(表2)。

2.2.2 亞麻低鉀差異表達基因篩選 本研究將差異表達基因的差異倍數閾值設為≥2.0,-value閾值設為≤0.05。利用-value閾值＜0.05和log2ratio的絕對值≥1來篩選出低鉀的差異表達基因。低鉀12 h鑒定到1154個(508個上調表達, 646個下調表達)低鉀響應表達基因。低鉀96 h差異表達基因明顯減少, 共鑒定到247個(131個上調表達, 116個下調表達)低鉀響應表達基因。圖4-A展示了不同低鉀時期的差異表達基因的異同情況, 18個基因在兩時期均響應, 其中上調基因8個, 下調基因10個, 推測這些基因可能在整個低鉀時期有重要功能。圖4-B顯示低鉀對照組和處理組差異基因數。比較這些結果消除了基因表達與時間和生長相關的自然變異。在CK組和KS組中, 有886個基因共同表達, 其中343個基因上調, 543個基因下調。

2.3 GO功能富集

對差異表達基因(1154個)進行GO功能富集發現, 在12h-KS vs. 12h-CK對比組差異基因主要富集于代謝過程、細胞進程、單一生物過程、催化活性和結合功能五大類(圖5)。

表2 亞麻12個轉錄組數據的主要特性

A: 亞麻低鉀處理后12 h和96 h差異基因數; B: 低鉀對照組和處理組差異基因數。

A: the number of DEGs at 12 h and 96 h after low-K+treatment in flax; B: the number of DEGs in control and low-K+treatment.

2.4 KEGG通路富集

為進一步理解差異表達基因的功能, 將12h-KS vs 12h-CK對比組所有差異基因(1154個)與KEGG數據庫比對, 確定差異表達基因參與的最主要的能量代謝(光合有機物固碳、光合作用), 碳水化合物代謝(戊糖、果糖磷酸途徑、甘露糖代謝)、碳代謝、氨基酸代謝、萜類化合物代謝和植物激素信號轉導通路(圖6)。差異表達基因中有本研究關注的pathway注釋的基因為5個, 富集的途徑有5條, 包括光合作用途徑(photosynthesis) 1條、植物激素信號轉導途徑(plant hormone signal transduction) 3條及萜類主鏈生物合成途徑(Terpenoids backbone biosynthesis) 1條。其中基因(MSTRG.20565.1)表達量上調2.64倍, 在光合作用途徑中負責K+運輸; 基因(MSTRG.7397.8)表達量上調8.52倍, 在生長素合成途徑中負責生長素的合成; 基因(MSTRG.25736.1)表達量下調1.81倍, 在細胞分裂素合成途徑中負責細胞分裂素的合成; 基因(MSTRG.16160.5)表達量下調6.23倍, 在乙烯合成途徑中負責乙烯的合成; 基因(MSTRG.5636.3)表達量下調1.86倍, 在萜類主鏈生物合成途徑中負責細胞壁的合成。

2.5 差異表達基因的功能分析

2.5.1 亞麻低鉀下與鉀直接相關基因篩選 本研究在亞麻低鉀轉錄組數據的差異基因中篩選出7個與鉀直接相關基因(表3), 包括4個鉀運輸蛋白(MSTRG.20565.1、MSTRG.24915.2、MSTRG.10817.1和MSTRG.6817.1), 2個鉀通道蛋白(MSTRG.4695.1和MSTRG.30540.1)及1個鈉鉀鈣交換蛋白(MSTRG.14498.2)。其中2個上調基因(MSTRG.20565.1和MSTRG.4695.1), 5個下調基因(MSTRG.24915.2、MSTRG.10817.1、MSTRG.30540.1、MSTRG.14498.2和MSTRG.6817.1), 這些基因可能在鉀脅迫響應中起重要作用。

本研究發現, 許多差異表達基因在低鉀脅迫信號轉導和離子轉運體調控通路中扮演重要角色, 如附圖1。1個AKT通道蛋白(上調2.15倍), 參與鉀通道轉運, 響應于非生物脅迫; 19個CIPK信號轉導蛋白(上調1.46~11.76倍), 參與鈣信號傳導, 響應于非生物脅迫; 1個CML信號轉導蛋白(上調3.74倍), 參與鈣信號傳導, 影響植物生理代謝; 2個ARF信號轉導蛋白(下調3.25倍和4.61倍), 參與生長素調控, 影響側根發育; 5個NRT轉運蛋白(下調1.14~4.69倍), 參與硝酸鹽轉運, 影響植物的生長發育。鑒于這些基因直接參與鉀信號傳導及K+運輸, 與Wang等[22]報道一致。推測低鉀脅迫將直接影響這些基因的表達, 進而影響亞麻中鉀信號的傳導及K+運輸, 從而影響亞麻的表型。

表3 亞麻低鉀下7個與鉀直接相關基因篩選

2.5.2 亞麻低鉀下與激素相關基因篩選 在所有差異對比組中, 共103個基因注釋到激素響應蛋白功能, 包括17個ABA響應蛋白、16個乙烯響應蛋白、22個生長素響應蛋白、10個JA響應蛋白以及38個細胞分裂素響應蛋白。本研究發現, 13個與激素直接相關的基因(表4), 其中1個(上調8.52倍), 一種植物生長素受體, 參與植物生長調控; 2個(下調1.44倍和1.51倍), 生長素響應基因, 應答生長素效應; 1個(下調9.62倍), 生長素初期響應基因; 2個(下調3.02倍和3.58倍), 植物生長素原初反應基因, 參與植物生長素調節; 1個(下調1.81倍), 一種組氨酸磷酸轉移蛋白, 參與細胞分裂素的負向調控; 1個(下調10.02倍), 乙烯信號關鍵基因, 參與乙烯信號通路的正向調控; 2個(下調1.20倍和3.10倍), 負反饋調控, 參與乙烯信號轉導; 3個(下調6.23倍、1.90倍和7.72倍), 介導乙烯受體的信號負調控乙烯反應。

本研究篩選出生長素合成通路6個基因, 包括1個、2個、1個、2個, 低鉀脅迫下, 這些基因調控亞麻植株生長, 造成植株矮化; 細胞分裂素合成通路1個基因, 低鉀脅迫下,調控細胞分裂, 造成亞麻植株矮化的表型; 乙烯合成通路6個基因, 包括3個、1個、2個, 低鉀脅迫下, 這些基因引起亞麻植株衰老, 即葉片變黃(附圖2)。這3個通路為揭示植物激素對低鉀脅迫反應分子機制奠定基礎[23]。低鉀脅迫可能誘導這些基因差異表達, 調控激素合成, 進而影響亞麻的生長發育。

表4 亞麻低鉀下13個與激素相關基因篩選

2.5.3 亞麻低鉀下與纖維素相關基因篩選 本研究在差異表達基因中篩選出6個與纖維素相關基因(表5), 包括2個(下調8.70倍和2.13倍), 組成胞泌復合體的關鍵亞基, 參與復合體在靶膜組裝; 2個(下調2.03倍和1.73倍)及1個(下調1.94倍), 植物糖磷脂酰肌醇錨定蛋白, 定向微纖絲, 突變后阻礙纖維素合成; 1個(下調1.86倍), 一種雙特異性蛋白激酶, 參與纖維素合成。本研究篩選出2個、2個、1個和1個(附圖3), 鑒于這些基因直接參與纖維素合成[24], 低鉀脅迫可能誘導這些基因表達, 抑制亞麻纖維素合成, 進而調控產量形成。

表5 亞麻低鉀下6個與纖維素相關基因篩選

2.6 RNA-Seq和qRT-PCR相關性

為驗證轉錄組測序分析結果, 隨機選取、、、、、、和等8個基因用于qRT-PCR分析。2種方法得到的基因表達變化數據相關系數2達到0.91 (圖7), 說明RNA-seq測序數據相對準確, 低鉀相關基因表達量結果可信。

3 討論

3.1 低鉀對亞麻表型的影響及亞麻響應低鉀的時間

植物長期受到低鉀脅迫時, 會出現黃化病, 老葉先顯現癥狀[25]。植物低鉀影響莖葉及根的生長發育[26-27]。植株莖葉低鉀早期老葉葉尖失綠。隨低鉀時間增加, 萎黃癥狀從老葉轉移到新葉。嚴重低鉀時, 植物葉子從葉尖到整個葉緣顯現出萎黃病, 最終壞死。隨腐胺在葉片中積累, 植物葉片萎黃并發生大量褐斑。與上述植物低鉀表型相似, 低鉀亞麻植株出現葉片邊緣變黃癥狀, 并表現出矮化的表型。

研究表明, 西瓜低鉀響應早期和后期的時間點分別為6 h和120 h[28]。而本研究通過亞麻低鉀8個時間點篩選出12 h和96 h為亞麻低鉀響應的早期和后期時間點。與西瓜低鉀響應不同的是, 亞麻低鉀響應早期時間(12 h)晚于西瓜(6 h), 但亞麻后期響應時間(96 h)早于西瓜(120 h)。

3.2 植物低鉀脅迫的信號轉導和離子轉運體調控

本研究2個ARF信號轉導蛋白(下調3.25倍和4.61倍), 參與生長素調控, 影響側根發育; 5個NRT轉運蛋白(下調1.14~4.69倍), 參與硝酸鹽轉運, 影響植物的生長發育。鑒于這些基因直接參與鉀信號傳導及鉀離子運輸, 與Wang等[22]報道一致。推測低鉀脅迫將直接影響這些基因的表達, 進而影響亞麻中鉀信號的傳導及K+運輸, 從而影響亞麻的表型。

鉀是植物生長所需的主要營養物質。對低K+條件的適應性機制主要為鈣調磷酸酶B樣蛋白(Calcineurin B-like Calcium Sensors, CBL)和CBL相互作用激酶(CBL-Interacting Protein Kinases, CIPK)組成的Ca2+信號網絡。低鉀脅迫信號轉導和離子轉運體調控通路涉及大量膜上K+信號轉導蛋白和離子通道基因及細胞質和核中一些信號轉導蛋白及離子轉運蛋白。低鉀脅迫通過調控細胞質和細胞核中一些信號轉導蛋白影響膜上相關信號轉導蛋白和離子通道基因表達(附圖1)[22]。本研究低鉀脅迫發現大量差異表達基因, AKT通道蛋白在亞麻低鉀處理后其表達量上調2.15倍, 而擬南芥中CIPK23及KC1協同調控AKT1介導低鉀脅迫[29], 水稻中過表達AKT1可通過提高組織內K+含量提高植株對滲透和干旱脅迫抗性[30], 說明AKT通道蛋白在亞麻和擬南芥或水稻有類似功能; 發現CIPK信號轉導蛋白在亞麻低鉀處理后其表達量上調1.46~11.76倍, 而楊樹中CBL-CIPK信號通路可通過調控Shaker-like鉀通道增加對低鉀脅迫耐受性[31], 說明CIPK信號通路在亞麻和楊樹有類似功能; 發現ARF信號轉導蛋白在亞麻低鉀處理后其表達量下調3.25倍和4.61倍,而擬南芥中低鉀脅迫下ARF2磷酸化可解除對K+轉運基因抑制, 促進鉀吸收[32], 說明ARF信號轉導蛋白在亞麻和擬南芥有類似功能; 發現NRT轉運蛋白在亞麻低鉀處理后其表達量下調1.14~4.69倍, 而擬南芥中NPF7.3/NRT1.5介導的NO3–遷移可通過調控SKOR影響K+從根到芽遷移[33], 說明NRT轉運蛋白在亞麻和擬南芥有類似功能。鑒于這些基因在低鉀脅迫亞麻中的表達明顯改變, 推測這些基因在亞麻對低鉀脅迫的響應中發揮著重要作用。

3.3 植物激素在低鉀脅迫中的作用

植物激素廣泛參與逆境生理和生化反應。乙烯是植物對非生物脅迫應答中重要信號分子之一, 它與乙烯受體等主要轉錄因子結合, 激活下游基因表達, 觸發乙烯應答[34]。生長素可誘導ARF/AUX/GH3等基因在植物脅迫應答中快速瞬時高表達[35]。脫落酸作為植物地下-地上部分之間信息傳遞的中心媒介, 通過激活K+進出細胞路徑誘導細胞膨脹壓變化[36]。植物激素也相互影響, 乙烯和生長素通過抑制主根生長而促進根毛伸長, 從而對低鉀脅迫下根系形態發育起指導作用。生長在低鉀條件的植物根形態類似于生長在響應外源乙烯和生長素處理的形態[37]。低鉀條件下, 乙烯合成和信號轉導相關基因表達增強[38]。

4 結論

利用qRT-PCR篩選出亞麻對低鉀響應強烈的3個標記基因及內參分別為:、、和。鉀脅迫相關基因對低鉀響應高峰時間出現在12 h和96 h。通過低鉀轉錄組數據的分析和挖掘, 確定7個與鉀直接相關基因(4個鉀運輸蛋白、2個鉀通道蛋白及1個鈉鉀鈣交換蛋白), 低鉀脅迫直接影響亞麻這些基因的表達, 進而影響亞麻中鉀信號的傳導及K+運輸; 確定13個與激素相關基因(生長素合成通路6個基因、細胞分裂素合成通路1個基因和乙烯合成通路6個基因), 低鉀脅迫誘導這些基因表達, 調控激素合成, 進而影響亞麻生長發育; 確定6個與纖維素合成相關基因(2個、3個和1個基因), 低鉀脅迫誘導這些基因表達抑制亞麻纖維素合成, 進而調控產量形成。

[1] 中國農業科學院土壤肥料研究所. 中國化肥區劃. 北京: 中國農業科技出版社, 1986. pp 13–15. Institute of Soil and Fertilizer, Chinese Academy of Agricultural Sciences. Fertilizer Regionalization in China. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 1986. pp 13–15 (in Chinese).

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附圖1 亞麻低鉀脅迫的信號轉導和離子轉運體調控通路[22]

Fig. S1 Signal transduction and ion transporter regulation in responses to low-K+stress in flax[22]

a: 低鉀脅迫處理的植株表型; b: 對照的植株表型。植物能感知外界低K+脅迫, 并在植物細胞中產生低K+信號。信號(Ca2+、ROS等)可在細胞溶質中轉導, 最終在轉錄和翻譯后水平調節下游靶點(尤其是K+通道和轉運體)。“P”表示磷酸化, “X”表示抑制作用。

a: plant phenotype of low-K+treatment; b: plant phenotype of control. Plants are able to perceive external low-K+stress and generate low-K+signals in plant cells. The signals (Ca2+, ROS, etc.) can be transducted in cytosol, and eventually regulate the downstream targets (particularly K+channels and transporters) at transcriptional and posttranslational levels. P represents phosphorylation and X indicates inhibition effect.

附圖2 亞麻低鉀下生長素、細胞分裂素和乙烯合成通路相關基因[23]

Fig. S2 Genes related to auxin, cytokinin and ethylene synthesis pathway under low-K+in flax[23]

a: 低鉀脅迫處理的植株表型; b: 對照的植株表型。矩形框為參與這些途徑的蛋白質。蛋白質-蛋白質相互作用用箭頭表示。箭頭表示激活, 短橫線表示抑制, 交叉線表示解離, 直虛線箭頭表示間接作用, +u表示泛素化。

a: plant phenotype of low-K+treatment; b: plant phenotype of control. Rectangular boxes indicate proteins be involved in these pathways. Protein-protein interactions are represented by arrows. Arrows represent an activation, bar-headed lines an inhibition, crossed lines a dissociation, dotted arrows an indirect effect, +u denotes ubiquitination.

附圖3 亞麻低鉀下纖維素合成通路相關基因[24]

Fig. S3 Genes related to cellulose synthesis pathway under low-K+in flax[24]

Transcriptome profiling of flax (L.) response to low potassium stress

HUANG Wen-Gong1, JIANG Wei-Dong1, YAO Yu-Bo1, SONG Xi-Xia1, LIU Yan1, CHEN Si1, ZHAO Dong-Sheng1, WU Guang-Wen1, YUAN Hong-Mei1, REN Chuan-Ying2, SUN Zhong-Yi3, WU Jian-Zhong4, and KANG Qing-Hua1,*

1Institute of Industrial Crops, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China;2Food Processing Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China;3Institute of Animal Husbandry Research, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China;4Institute of Forage and Grassland Science, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China

Potassium (K) is an essential element for the growth and development in flax. Transcriptome sequencing and qRT-PCR were used to investigate the regulation of differential gene expression after 12 h and 96 h of low-K+treatment. The results showed that the leaf edge of flax treated with low-K+for 7 days turned yellow, and the plants were dwarfed compared with the control.(Lus K channel 1),(Lus STELAR K+outward rectifier) and(Lus high affinity K+transporter 5) were detected to respond to low-K+with response peak time of 12 h and 96 h. Compared with the control, 1154 differentially expressed genes (DEGs) (508 up-regulated and 646 down-regulated genes) were identified in low-K+treatment for 12 h. GO enrichment showed that DEGs were mainly concentrated on five categories: metabolic process, cellular process, single biological process, catalytic activity and binding function. KEGG pathway enrichment showed that DEGs involved in energy metabolism, carbohydrate metabolism, carbon metabolism, amino acid metabolism, terpenoid metabolism and plant hormone signal transduction pathways. Furthermore, 7 genes directly related to K (4K transporters, 2K channel proteins and 1 sodium-potassium-calcium exchanger protein), 13 genes related to hormone and 6 genes related to cellulose synthesis were screened. Among the 7 genes directly related to K, the relative expression of 2 genes were up-regulated by 1.75 and 2.64 times and 5 genes down-regulated by 1.21–9.57 times. In summary, DEGs preliminarily revealed the transcriptional regulation pathway involved in low-K+in flax, which laid a foundation for cloning and functional verification of flax low-K+tolerance related genes.

flax; low potassium; transcriptome profiling; differentially expressed genes

10.3724/SP.J.1006.2021.04133

本研究由國家重點研發計劃項目(2018YFD0201100), 黑龍江省現代農業產業技術協同創新體系麻類藥用資源遺傳改良與創新利用協同創新崗(YYM19SQ-24), 國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-16-E04)和黑龍江省農業科學院科技創新工程專項(2019JCQN003, HNK2019CX08-05)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0201100), the Heilongjiang Province Modern Agricultural Industry Technology Collaborative Innovation System-Hemp (medicinal) Resources Genetic Improvement and Innovative Utilization Collaborative Innovation Post (YYM19SQ-24), the China Agriculture Research System (CARS-16-E04), and the Science and Technology Innovation Project of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences (2019JCQN003, HNK2019CX08-05).

康慶華, E-mail: qinghuakang111@163.com

E-mail: huangwengong1736@163.com

2020-06-22;

2020-11-13;

2020-12-15.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201215.0849.006.html