玉米生長素響應因子家族基因的表達模式分析

李文蘭 李文才 孫 琦 于彥麗 趙 勐 魯守平 李艷嬌 孟昭東

玉米生長素響應因子家族基因的表達模式分析

李文蘭 李文才 孫 琦 于彥麗 趙 勐 魯守平 李艷嬌 孟昭東*

山東省農業科學院玉米研究所 / 小麥玉米國家工程實驗室 / 農業部黃淮海北部玉米生物學與遺傳育種重點實驗室, 山東濟南 250100

生長素響應因子(auxin response factor, ARF)是一類重要的轉錄因子, 通過特異性地結合生長素響應元件調節下游靶基因的轉錄, 參與諸多植物生長發育過程的調控。玉米中有許多家族基因, 但其表達模式有待深入研究。本研究分析了玉米家族基因在不同組織器官中的表達, 發現除、和組成型表達外, 其余32個基因的表達水平在生殖器官中要明顯高于營養器官。對基因啟動子區的順式作用元件分析顯示, 28個基因的啟動子區含有逆境脅迫相關順式元件, 實時定量PCR分析結果顯示, 多個基因分別響應冷、熱、鹽和滲透脅迫。研究結果不僅暗示了家族基因在玉米生殖生長和非生物逆境脅迫響應中的重要性, 也為全面解析基因在玉米中的生物學功能提供有用信息。

; 表達; 逆境脅迫; 玉米

生長素響應因子(auxin response factor, ARF)是植物所特有的一類轉錄因子[1], 通過特異性地結合生長素響應元件(AuxREs)調節下游靶基因的轉錄, 參與諸多植物生長發育過程的調控, 例如向性運動、頂端優勢、干旱脅迫響應等。研究基因的表達模式對于全面了解玉米基因家族的生物學功能具有重要意義。

生長素信號轉導過程涉及早期響應基因(、和基因家族等)和與AuxREs相互作用的家族基因[2]。ARF蛋白結合到生長素調控基因啟動子區的生長素響應元件(5'-TGTCTC-3')上, 抑制或激活這些基因的轉錄[3], 從而影響植物的生長發育。擬南芥、水稻、二穗短柄草、鷹嘴豆和丹參等多種植物中的基因已有相關研究[4-9]。擬南芥中第一個被發現的轉錄因子是, 是以人工合成的生長素響應元件為誘餌,通過活性很高的酵母單雜系統克隆得到的[3]。ARF1蛋白包括665個氨基酸, N端包含1個DNA結合結構域; 中間的一段區域富含脯氨酸, 絲氨酸和蘇氨酸含量也較高[3], 與其他富含脯氨酸結構域的轉錄抑制子和轉錄激活子序列類似[4], 該區域可能是轉錄抑制或轉錄激活結構域; C端與基因編碼蛋白的結構域III和IV有類似結構[3,10]。擬南芥中有22個基因編碼ARF蛋白[11], 其中參與胚胎發生與維管形成[12];參與植物向光性和向重力性[13];控制葉擴展和側根生長, 并與表現出功能冗余性[14-15];和參與花成熟調控, 且呈現功能冗余性[16]。此外, 馬鈴薯參與頂端休眠, 調控與頂端分生組織連接維管束的發育[17]; 水稻受生長素誘導, 參與胚芽鞘的向性運動[18]; 番茄也是家族基因, 參與種子發育、幼苗生長和果實成熟[19]。

玉米有35個基因[20], 基因結構和進化關系等已有相關分析, 但其表達模式還有待深入研究。關于基因在玉米不同組織器官中的表達模式以及在冷、熱、鹽和滲透脅迫下的表達模式還未見詳細報道。Liu等[20]通過全基因組序列分析, 找到了35個玉米基因, 并對基因結構和進化關系等進行了分析。本研究擬通過分析基因在玉米不同組織器官中的表達模式以及在冷、熱、鹽和滲透脅迫下的表達模式, 探究基因在玉米生長發育和逆境脅迫響應過程中的作用, 為全面解析玉米基因的生物學功能提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與生長條件

試驗所用的玉米材料是B73自交系。分別取材播種后14 d (V3時期)的初級根、第2片葉、整個幼苗植株、播種后25 d (V5時期)的中部莖稈和播種后34 d (V7時期)的整個幼嫩雄花序及雌花序, 用于實時定量PCR分析。逆境脅迫試驗所用的材料在光照培養箱中進行長日照培養(16 h光照/8 h黑暗), 生長14 d。冷脅迫處理是將幼苗置于4℃培養箱中進行處理, 熱脅迫處理是將幼苗置于40℃培養箱中進行處理, 鹽脅迫處理是利用250 mmol L–1的NaCl對幼苗進行處理, 滲透脅迫處理是利用15% PEG-6000對幼苗進行處理。每種脅迫處理均在處理0、1、2、4和8 h后, 收集對照植株和處理植株的第2片葉用于實時定量PCR分析。

1.2 RNA提取和實時定量PCR分析

利用天根的多糖多酚總RNA提取試劑盒提取各樣品的總RNA, 按照反轉錄試劑盒說明書完成cDNA的合成和純化。實時定量PCR分析利用Bio-Rad CFX96實時定量檢測系統(Bio-Rad, Hercules, CA, USA), 引物序列見表1,基因作為內參基因, 根據2-DDCT計算基因相對表達量。對于脅迫處理下玉米幼苗的qRT-PCR分析, 將各處理0 h各基因表達量設為1, 并以此對照計算其在其他時間點的相對表達量。實驗數據通過SPSS18.0軟件進行差異性分析。

1.3 利用轉錄組數據對ARF基因進行表達分析

利用從MaizeGDB數據庫獲得的玉米基因的ID號在Genevestigator網站(http://www.genevestigator. com/gv/)搜索基因在不同組織器官中的轉錄表達數據, 然后利用Genevestigator網站的系統軟件對轉錄組表達數據進行分析, 獲得基因在不同組織器官中的表達模式熱點分布圖[21]。

1.4 啟動子區順式作用元件分析

利用Gramene網站(http://ensembl.gramene.org/ Zea_mays/Info/Index)搜索確定玉米家族基因起始密碼子上游1500 bp的啟動子區序列, 利用PlantCare數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)的順式作用元件分析工具, 對玉米家族基因啟動子區序列進行順式作用元件分析[22]。

2 結果與分析

2.1 玉米ARF家族基因在不同組織器官中的表達分析

為探究生長素響應因子家族成員在玉米中的表達模式, 我們利用實時定量PCR方法對基因在6種不同組織器官(根、莖、葉、幼苗、幼嫩雄花序和幼嫩雌花序)中的表達量進行了檢測(圖1)。、和在玉米中組成型表達,在莖、幼苗和雄花序中高表達,在葉和雌花序中高表達, 而剩余的30個基因均在雄花序和雌花序中優勢表達。從整體空間表達上看, 各基因的表達量高低呈現生殖器官>營養器官。玉米花序發育涉及小穗對原基、小穗原基、花器官原基等各類原基發育起始過程, 在這些原基起始部位都存在生長素積累和轉運[23]。作為生長素響應因子,基因在雌花序和雄花序中高水平表達, 暗示基因參與花序發育調控過程。

表1 實時定量PCR的引物序列

(續表1)

2.2 轉錄組數據庫中玉米ARF家族基因在不同組織器官中的表達分析

為進一步了解玉米家族基因的表達模式, 我們利用Genevestigator數據庫中的轉錄組數據對家族基因在更多不同組織器官(41個組織器官)中的表達模式進行了分析, 共獲得31個玉米基因(未獲得、、和這4個基因的表達信息)的表達信息, 結果如圖2所示。除了花粉,、和在所檢測的其余組織器官中均有表達, 這與實時定量PCR結果基本吻合。

和在花藥中優勢表達, 這與定量結果顯示其在雄花序中優勢表達是一致的。此外, 除了和, 其余29個玉米基因在雌花序發育(pistil, ovary, ear, spikelet)和種子發育過程(embryo, endosperm, embryo sac, embryo-surrounding region, basal endosperm transfer layer)中均有較高的表達量。這與實時定量PCR結果顯示基因在生殖器官發育過程中優勢表達也是一致的。然而, 與定量結果顯示基因在莖中低表達(除了和)相反, 有29個基因(除和)在莖中具有較高的表達水平。這可能是由于取材時期和試驗材料不同所造成的結果差異。結合轉錄組數據和實時定量PCR結果, 我們可以推測基因在玉米生長發育和生殖器官發育過程中均發揮著重要的作用。

R: 根; ST: 莖; L: 葉; S: 幼苗; T: 雄花序; E: 雌花序。圖柱上的不同字母代表Duncan’s multiple range tests的顯著差異(< 0.05)。

R: root; ST: stem; L: leaf; S: seedling; T: tassel; E: ear. Values marked with different letters indicate significant differences at< 0.05 by Duncan’s multiple range tests.

圖中每個基因在所有檢測組織器官中的表達量設為100%, 顏色的深淺代表表達百分率。

The relative expression of each gene in all detected tissues and organs was set at 100%, and the shade of color represents the percentage of relative expression levels.

2.3 玉米ARF家族基因的順式作用元件分析

為更好了解玉米家族基因在逆境脅迫響應過程中的作用, 我們對玉米家族基因起始密碼子上游1500 bp的啟動子區進行順式作用元件分析(表2), 除轉錄和光響應相關必需順式作用元件, 在玉米家族基因的啟動子區找到大量順式作用元件, 根據功能可分為: 植物激素響應相關順式作用元件(Element A)、生長發育相關順式作用元件(Element B)和逆境脅迫相關順式作用元件(Element C)。Element A中的脫落酸響應元件(ABRE)分布于除和ARF19之外的每一個基因啟動子區, 茉莉酸甲酯響應元件(CGTCA-motif, TGACG-motif, MeJA-responsive element)分布在除ARF14、、、和ARF35之外的30個基因啟動子區, 赤霉素響應元件P-box (gibberellin-responsive element)和GARE-motif (gibberellin-responsive element)分別位于、、、、、、、、、和、、、、、、、、、的啟動子區, 生長素響應元件AuxRR-core和TGA-element分別位于、、、和、、、、、、、、、、和的啟動子區。Xing等[24]分析了31個基因啟動子區的生長素響應元件, 與本文結果基本吻合。Element B中的分生組織相關響應元件(CAT-box)位于、、、、、、、、、、、、、、、、和的啟動子區, 種子特異調控響應元件(RY-element)分布在、、、和的啟動子區, 生物鐘相關響應元件(circadian)只分布在和的啟動子區, 胚乳表達相關元件(GCN4_motif)只分布在和的啟動子區。Element C中的低溫響應元件(low temperature- responsive element, LTR)位于、、、、、、、、、、、、、和的啟動子區, 干旱脅迫響應元件(MYB binding site involved in drought-inducibility, MBS)位于、、、、、、、、、、、、、、、和的啟動子區, 防御脅迫響應元件(TC-rich repeats)位于、、、、和的啟動子區, 水楊酸響應元件(TCA-element)位于、、、、、、、、、和的啟動子區。其中, 植物激素響應相關順式作用元件最多, 每個基因都含有2~15個; 生長發育相關順式作用元件分布在23個基因的啟動子區, 主要包括RY-element、GCN4-motif和circadian等; 逆境脅迫相關順式作用元件主要分布在29個基因的啟動子區, 主要包括MBS、LTR和TC-rich repeats等。每個基因的啟動子區都包含多個順式作用元件, 表明玉米基因在植物激素響應、生長發育和逆境脅迫響應等方面均發揮重要作用。

表2 玉米ARF家族基因啟動子區的順式作用元件

ABRE: 脫落酸響應元件; AuxRR-core和TGA-element: 生長素響應元件; CGTCA-motif和TGACG-motif: 茉莉酸甲酯響應元件; GARE-motif和P-box: 赤霉素響應元件; CAT-box: 分生組織相關響應元件; circadian: 生物鐘相關響應元件; GCN4_motif: 胚乳表達相關元件;RY-element: 種子特異調控響應元件; LTR: 低溫響應元件; MBS: 干旱脅迫響應元件; TC-rich repeats: 防御脅迫響應元件; TCA-element: 水楊酸響應元件。肩標數字代表每個順式作用元件在基因啟動區的拷貝數。

ABRE: ABA-responsive element; LTR: low temperature-responsive element; MBS: MYB binding site involved in drought-inducibility. The shoulder number represents the number of copies of each cis-acting element in thegene promoter region.

2.4 玉米ARF家族基因在冷、熱、鹽和滲透脅迫條件下的表達分析

順式作用元件分析顯示有29個玉米基因啟動子區包含逆境脅迫相關順式作用元件。為進一步研究玉米家族基因在逆境脅迫響應過程中的作用, 我們選取了9個在葉片中表達量較高的基因(、、、、、、、和), 利用實時定量熒光PCR方法檢測玉米家族基因在冷、熱、鹽及滲透脅迫下的表達量變化(圖3)。在冷脅迫處理下, 所有被檢測基因的表達模式都是類似的, 在處理1 h時表達量迅速上升, 隨后降到較低水平, 處理4 h后又開始上升。在熱脅迫處理下,基因1 h時表達量達到峰值, 是未處理時的25倍, 隨后又逐漸下降, 而其余8個基因的表達量則是隨著時間逐漸上升。在鹽脅迫處理下, 多數基因的表達量變化不大(除了在處理4 h時表達量達到峰值隨后又開始下降外), 比較有趣的一點是,的表達量在處理后迅速下降并維持在較低水平, 暗示該基因可能是通過與其他基因相反的途徑參與鹽脅迫調控過程。在滲透脅迫處理下,、和的表達量是先上升后下降, 在處理8 h時表達量達到峰值;、、和的表達模式是相似的, 處理1 h時表達量達到峰值, 隨后下降并維持在較低水平;和的表達量變化不大。這些結果表明,基因涉及參與多種逆境脅迫響應過程。

3 討論

作為重要的植物激素, 生長素幾乎參與了植物生長發育的每個階段。而基因作為生長素響應因子, 通過特異性地結合生長素響應元件調節下游靶基因的轉錄, 參與諸多植物生長發育過程[2]。根據標記基因表達情況可將家族分為3類: 一類(Clade A)具有轉錄激活功能, 一類(Clade B)具有轉錄抑制功能, 一類(Clade C)既不具有轉錄激活功能也不具有轉錄抑制功能[25]。這3類基因的功能分類與進化關系是一致的[26]。結合不同數據庫分析得到的轉錄組數據和實時定量PCR結果可以看出, Clade C主要在幼嫩雄花序中優勢表達, 而Clade A和Clade B則主要在幼嫩花序中高水平表達, 有的在幼嫩雌花序中優勢表達, 有的在雄花序中優勢表達。不管基因通過轉錄激活(Clade A)還是轉錄抑制(Clade B), 又或者通過別的調控途徑(Clade C), 都會通過參與調控生長素相關基因影響玉米花序發育過程。

A: 冷脅迫處理; B: 熱脅迫處理; C: NaCl脅迫處理; D: 滲透脅迫處理。

A: cold stress treatment; B: hot stress treatment; C: NaCl stress treatment; D: osmotic stress treatment.

基因參與了諸多生物學過程。擬南芥中的突變體花期、葉衰亡和花脫落時間推遲[27], 推測與之同源的玉米和也參與花發育和葉片發育, 而這2個基因都在幼嫩花序中優勢表達, 也從側面印證這一推測;參與胚模式建成和維管組織形成[12,28-29], 而作為同源基因的玉米在幼嫩花序和中柱中高表達,在幼嫩花序和果皮中高表達, 這也暗示這2個基因可能參與胚發育和微管形成;調控花成熟[16,30], 同源基因玉米和在幼嫩花序和胚中高表達, 可能參與花和果穗形成過程;是果實起始發育的負調控因子[16,30], 黃瓜的同源基因和在單性結實和非單性結實品種的表達差異大[31], 而玉米的同源基因和在幼嫩花序和胚中高表達, 推測參與果穗的發育和形態建成。然而玉米基因眾多, 通過DAP-seq測序技術獲得的順式作用元件分析結果顯示,基因在Clade A、Clade B和Clade C組間的結合位點特異性和靶基因等差異不大[32], 暗示基因功能冗余現象嚴重, 這也是至今還未發現有表型的玉米突變體的原因[25], 開展功能研究還需新的思路和方法。

隨著玉米基因組測序完成, 高通量測序技術被廣泛應用于基因功能研究。通過分析數據庫收錄的測序數據, 可以獲得不同部位組織器官在不同發育時期、不同環境條件下的表達模式。Liu等[20]通過EST數據庫預測基因主要在雄穗和果穗中表達, Gallavotti等[26]通過數據庫數據分析基因在胚、幼嫩花序和成熟花序中優勢表達, 而本文結合實時定量PCR方法和現有數據庫更新的轉錄組數據分析了玉米基因在不同組織器官的表達模式, 發現基因主要在雄花序和雌花序中優勢表達, 充分說明基因在花序發育過程中發揮重要功能。

基因在植物的生長發育過程中發揮了重要作用, 也參與了許多逆境脅迫響應過程。擬南芥參與維管形成, 而干旱條件下植株的維管合成能力加強, 暗示通過參與維管合成而影響植株的抗旱性[6];和通過控制根冠的發育來影響植株的抗旱性[33]; 大豆基因的表達量在水分脅迫下發生明顯變化, 暗示基因參與了大豆水分脅迫響應[34]。玉米中的基因在冷、熱、鹽和滲透脅迫處理下, 表達量均發生了明顯變化, 這暗示基因參與了玉米多種脅迫響應過程。

4 結論

玉米基因家族的、和呈組成型表達, 其余32個基因均在幼嫩雄花序和雌花序中高表達, 參與了玉米花序發育過程; 玉米基因家族在冷、熱、鹽和滲透脅迫處理下表達量發生明顯變化, 暗示玉米基因家族參與了多種逆境脅迫響應過程。

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A study of expression pattern of auxin response factor family genes in maize (L.)

LI Wen-Lan, LI Wen-Cai, SUN Qi, YU Yan-Li, ZHAO Meng, LU Shou-Ping, LI Yan-Jiao, and MENG Zhao-Dong*

Maize Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences / National Engineering Laboratory of Wheat and Maize / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Maize in Northern Yellow-Huai Rivers Plain, Ministry of Agriculture, Jinan 250100, Shandong, China

Auxin response factors (ARFs) are important transcription factors which control the expression of target genes by binding specifically to auxin response elements, and are involved in a series of developmental processes in plant species. In maize genome, dozens ofgenes are encoded, however, there is little known on their expression patterns. In this study, the analysis on the expression level ofgenes in diverse tissues and organs revealed that expression level of 32genes were higher in reproductive organs than that in vegetative organs, except,, andconstitutively expressed. The predicted results of-acting elements showed that the promoter regions of 28genes harbored the-regulatory elements related to abiotic stresses. Real-time quantitative PCR results indicated that expression of severalgenes showed a response to cold, heat, and osmotic stresses, respectively. The results highlighted the importance offamily genes in reproductive growth and abiotic stress response, and provided useful information for the comprehensive analysis of the biological function ofgenes in maize.

auxin response factor; expression; abiotic stress; maize (L.)

10.3724/SP.J.1006.2021.03043

本研究由山東省自然科學基金項目(ZR2019BC107)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2019BC107).

孟昭東, E-mail: mengzhd@126.com

E-mail: liwenlantutu@126.com

2020-07-07;

2020-11-13;

2020-12-15.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20201214.1748.004.html