小白菜次生代謝物質對小菜蛾雌蟲行為的調節作用

王占娣, 張 啦, 丁百蓮, 史云東, 王雅妮, 魯廣秋, 賈 琳*,

(1. 玉溪師范學院 化學生物與環境學院，云南 玉溪 653100；2. 遼寧金品生物科技有限公司，沈陽 110179)

小菜蛾Plutella xylostella L. 又名小青蟲，鱗翅目菜蛾科昆蟲，以幼蟲取食植物葉肉、嫩莖、幼莢和籽粒為害，其寄主范圍廣，包括十字花科、茄科、百合科、甘藍和姜科等植物40 余種，其中，十字花科植物是小菜蛾主要寄主[1]。在世界范圍內只要有十字花科植物種植的地區都有小菜蛾發生，因此，小菜蛾被稱為世界分布最為廣泛、蔬菜上最難防治且具毀滅性的鱗翅目類農業害蟲[2]。在中國，小菜蛾遍布所有省份，發生面積高達213.33 萬公頃[3]。北方地區一般從5 月中旬一直持續到10 月下旬。在熱帶和亞熱帶地區周年發生，特別是在云南地區，由于其特殊的氣候條件和蔬菜種植結構的調整，小菜蛾常年處于高峰期，且發生規律呈多樣化[4]。目前，小菜蛾的防治技術主要包括化學防治、生物防治和生態調控，其中化學防治是防治小菜蛾的主要手段，但由于化學農藥的大量使用，小菜蛾對90%以上的化學農藥已產生較強的抗性[1]。生物防治主要是利用寄生蜂、天敵和微生物等控制小菜蛾數量[5]，雖然生物防治在小菜蛾種群數量控制具有較大的優勢，但由于小菜蛾發生時期與以上生物發生時期存在時間差異，導致小菜蛾前期防治效果不明顯。害蟲生態調控是利用多作物和非作物生境的設計與布局[6]，通過改變昆蟲食物網組成結構調控害蟲種群。研究發現，小菜蛾對單一寄主植物釋放的揮發性物質具有明確的行為反應，而在多寄主植物共存時，小菜蛾對不同寄主植物的行為反應差異不明顯[7]。然而隨著產業的規模化和種植結構的調整，單一作物大面積種植結構逐漸增加，不利于害蟲生態調控，迫切需要尋找新型、高效、不易產生抗性、對環境友好的綠色防治技術和產品。

現代研究發現，植物中的次生代謝物質能夠調控植食性昆蟲的行為，干擾植食性昆蟲對植物作出的取食和產卵的定向/識別行為[8-11]。如郭明程等[12]研究發現，爵床甲醇提取物能干擾小菜蛾產卵行為；Keesey 等[13]報道，獼猴桃提取物對果蠅具有產卵趨避作用。王志宇等[14]報道，機械損傷后的薄荷對小菜蛾具有較強的驅避活性。在小菜蛾寄主植物，特別是十字花科蔬菜中，普遍存在有引誘小菜蛾取食和產卵的活性物質，這些物質能有效控制害蟲的發生及危害，可用于綠色防控產品的開發。但不同蔬菜品種所含的活性物質存在差異，如Reddy 等[15]報道，結球甘藍中含有6 個碳原子數的醇類或酯類，如1-己醇、1-己烯-3-醇、己醛、(E)-2-己醛、醋酸己酯、乙酸順-3-己烯酯 (綠葉氣體) 和 (Z)-3-醋酸己烯酯。韓寶瑜等[16]報道，白菜中含有烯丙基異硫氰酸酯、碳原子數在6～24 的烯烴類、酯類、醇類和綠葉氣體等。

小白菜Brassica campestrs L. ssp. Chinensis var. communis 為十字花科蕓薹屬小白菜亞種蔬菜，具有生長周期短、適應性強、產量高等特點。在中國各地均有種植，其中，在長江中下游地區小白菜的種植面積可達30%～40%，在云南地區終年種植，年產量可達上萬噸[17]。目前，小白菜是小菜蛾的主要寄主之一，表明在小白菜的次生代謝物質中存在能夠使小菜蛾準確尋找和定位的活性物質，但至今未見有關小白菜中調節小菜蛾成蟲行為的活性物質的報道。因此，本研究采用不同極性溶劑提取小白菜中次生代謝物質，評價這些物質對小菜蛾雌蟲行為的調節作用，并鑒定其化學結構，探討小白菜次生代謝物質對小菜蛾行為的調節作用，尋找防治小菜蛾的先導化合物，旨在為小菜蛾的綠色防治奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料、試劑及藥劑

石油醚 (60%～90%) 和乙酸乙酯 (純度99.5%)，西隴科學股份有限公司；二氯甲烷 (純度99.5%)，國際集團化學試劑有限公司；無水乙醇 (純度99.7%) 重慶川東化工集團有限公司；二次蒸餾水。

1.2 主要儀器

YC-SXT-06 六聯脂肪儀，上海鄆曹電子有限公司；RE-52 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SQ8T 氣相-質譜聯用儀美國PerlinEler；QC-1B 大氣采樣儀，北京勞保所。

1.3 供試昆蟲

小菜蛾Plutella xylostella L. 幼蟲采集于云南省玉溪市江川區的芥藍田，在幼蟲時期區分出其性別后，將雌、雄蟲分別置于不同的盒子內，于室內用芥藍苗培養至孵化出小菜蛾成蟲。室內環境條件：溫度 (27 ± 1) ℃，相對濕度為60%～70%，光周期為L : D = 12 h : 12 h。

1.4 試驗方法

1.4.1 提取液的制備 稱取10 g 小白菜，利用六聯脂肪提取器，依次加入100 mL 不同極性溶劑 (石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇和石油醚)進行提取，提取時間以提取器內溶液顏色變淡為止。收集提取液，用旋轉蒸發儀濃縮至10 mL。將濃縮液稀釋至最終質量濃度分別為0.5、0.25、0.125 g/mL，于4 ℃下保存，備用。

1.4.2 提取液中化學成分的鑒定 采用氣相色譜-質譜聯用儀 (GC-MS) 鑒定提取液中化學成分。檢測條件如下。

GC：進樣量1.0 μL；分流比20 : 1；進樣溫度250 ℃。程序升溫：初始溫度40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 升溫至260 ℃，保持10 min。

MS：傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；掃描線：Tic(全掃描)；柱子：Ei 比-5MS(30 mm ×0.25 mm × 0.25 mm)；離子源70 eV；掃描時間和GC 時間一致，掃描范圍m/z 33～550。

1.4.3 行為評價 取兩個直徑為0.8 cm 的濾紙片，分別滴加100 μL 質量濃度為0.5、0.25 和0.125 g/mL 的小白菜提取液。以等量的溶劑作對照 (CK)。自然晾干。將濾紙片分別置于Y 型管的兩個支管中，主管引入20 頭未交配的小菜蛾雌蟲，風速控制在3～5 cm/min，設4 次重復，30 min后記錄各支管中小菜蛾的數量。按 (1) 式計算小菜蛾的反應率。

R：反應率；NTr：處理組蟲量；NCK：對照組蟲量。

1.4.4 田間誘捕雌蟲試驗 試驗安排在玉溪師范學院試驗田內，面積22 m2，種植蔬菜為甘藍。將小白菜蒸餾水提取液和無水乙醇提取液均配制成質量濃度為0.5 g/mL，作為供試液。取200 μL 供試液滴加到橡膠芯中作為處理。分別以等量的蒸餾水和無水乙醇作為對照。將橡膠芯懸掛于自制的簡易誘捕器中。按照隨機分組的方式，將誘捕器放在甘藍田的不同位置，誘捕器局距離地面的高度為20 cm，3 d 后記錄誘捕器內小菜蛾雌蟲的數量。每處理2 次重復。

1.5 數據處理

試驗數據利用SAS 8.0 軟件進行分析，采用x2分析處理組與CK 組之間的差異性 (α = 0.05)；采用非均衡資料ANOVA 統計相同溶劑不同濃度提取液對小菜蛾雌蟲行為調節作用 (α = 0.05)。

2 結果與分析

2.1 小白菜提取液對小菜蛾雌蟲行為的調節作用

2.1.1 小白菜不同極性提取液對小菜蛾雌蟲行為的調節作用 分別以石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷為溶劑提取小白菜，用得到的提取液處理小菜蛾雌蟲。結果發現，處理組成蟲數量隨著提取液濃度的增加而降低。當其質量濃度為0.5 g/mL時，小白菜的石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷提取液組成蟲數量明顯高于CK 組；當其質量濃度為0.25 g/mL 時，只有小白菜的二氯甲烷提取液組成蟲數量明顯高于CK 組 (圖1A、1B、1C)。而采用無水乙醇和蒸餾水提取小白菜時，其提取物組的成蟲數量隨著測試濃度的增加而增加，當其質量濃度分別為0.25g/mL 和0.125 g/mL 時，無水乙醇和蒸餾水提取液組的成蟲數量明顯高于CK(圖1D、1E)。結果表明，5 種不同溶劑提取物對小菜蛾雌蟲行為均具有調節作用，其中低極性物質在高濃度時及高極性物質在低濃度時對雌蟲具有引誘效果。

2.1.2 小白菜不同極性溶劑提取物調控小菜蛾雌蟲行為的比較 當提取物質量濃度在0.25～0.50 g/mL范圍內時，小白菜無水乙醇提取液處理組小菜蛾雌蟲數量與蒸餾水提取液處理組的差異不顯著。當質量濃度為0.125 g/mL 時，蒸餾水提取液組小菜蛾雌蟲數量明顯高于無水乙醇提取液處理組(圖2)。表明蒸餾水提取液對小菜蛾的引誘效果優于無水乙醇提取液。

2.2 田間誘捕效果

使用簡易誘捕器，以小白菜提取液為誘捕劑，田間誘捕3 d 后調查誘捕器內小菜蛾雌蟲數量。結果(圖3)顯示，溶劑對照誘捕到的蟲口數量明顯低于小白菜蒸餾水提取液和無水乙醇提取液，其中，蒸餾水提取液誘捕到的雌蟲數量最多，明顯多于無水乙醇提取液。表明小白菜蒸餾水中含有引誘小菜蛾的潛在活性物質。

2.3 提取液活性成分的分析

小白菜不同極性溶劑提取液總離子流色譜圖見圖4。結合NIST2012、WILEY 譜圖庫和文獻報道，確定小白菜提取液的化學成分。結果(表1)顯示，小白菜不同溶劑提取液中的主要成分為酯類、烷烴類、酮類、醇類、酸類、醛類和酰胺類。其中，二氯甲烷提取液中的主要成分為烷烴

類，乙酸乙酯提取液中的主要成分為酯類和少量的酰胺類；無水乙醇提取液中成分為醇類和酸類，分別為 Z -2-(9-十八烷烯氧基) 乙醇、9,12,15-十八碳三烯酸、棕櫚酸、3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-醇和8,11,14-二十碳三烯酸。小白菜蒸餾水提取液中的主要成分為異戊膽酸乙酯和9,12,15-十八碳三烯醛，其中異戊膽酸乙酯含量最高 。

表1 小白菜不同極性溶劑提取液主要化學成分Table1 The main chemical components of extraction from pakchoi with different polar solvents

3 結論與討論

綠色防治技術是現代農業害蟲防治研究的熱點，從植物次生代謝物質中篩選基于揮發物的化學生態調控技術是綠色防治技術研究的主要途徑。一般采用有溶劑浸提法、水蒸氣蒸餾法、頂空收集法和固相微萃取技術從植物中獲得調控昆蟲行為的次生代謝物質，這些物質主要為相對分子質量在100～200 之間的醇類、醛類、酮類、酸類、酚類、乙炔類、含氮化合物、有機酸、萜烯類和芳香類揮發性物質[15-17]。如采用頂空收集法[15]和頂空固相微萃取法[18]從白菜中鑒定的化合物有2,5-乙二醇、反-2-己烯-1-醇、芳樟醇、香葉醇、反-4-己烯-1-醇、異硫氰酸酯類物質和硫代葡萄糖苷等。本研究采用熱回流浸提法，利用5 種不同極性溶劑提取小白菜，對不同溶劑提取液進行成分分析發現，小白菜中的化合物主要為酯類、烷烴類、酮類、醇類、酸類、醛類、酰胺類和少量的酸類，這與采用頂空收集法和頂空固相萃取法提取的化合物種類相同。對強極性溶劑 (無水乙醇和蒸餾水) 提取液中的化合物進行分析發現，這些化合物的碳原子數在16～18 之間，相對分子質量在256～312 之間，碳原子數和相對分子質量均高于采用頂空收集法和固相微萃取技術得到的化合物。出現這種差異的原因可能為頂空收集法和頂空固相萃取法提取的物質為植物釋放低揮發性物質，而采用熱回流浸提法得到的物質主要為揮發性成分。

文獻報道，寄主植物中釋放的次生代謝物質對昆蟲取食、交配和產卵行為具有調節作用[19]。如Gerofotis 等[20]報道，橄欖果實和葉片釋放的揮發性物質有利于橄欖果蠅的交配。甘藍受機械損傷或蟲害后釋放的低揮發性物質對小菜蛾具有引誘效果[21]，番茄釋放的揮發物能誘導美洲棉鈴蟲雌蟲產卵[22]。本研究發現，小白菜5 種不同極性溶劑 (石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水) 提取液對小菜蛾雌蟲具有明顯的引誘效果，其中，無水乙醇和蒸餾水提取液的引誘效果明顯高于其他處理。對這兩種提取液的成分進行分析，發現在兩種提取液中含有具有相同母環結構的化合物，即9,12,15-十八碳三烯醛 (小白菜蒸餾水提取液) 和9,12,15-十八碳三烯酸 (小白菜無水乙醇提取液)。文獻報道碳鏈長度為10～18 的醛是鱗翅目昆蟲信息素的活性成分[23]，如9,12,15-十八碳三烯醛是美國白蛾性信息素的主要成分[24]。9,12,15-十八碳三烯酸又稱為亞麻酸，是植物揮發性物質合成的前體物質[25]。棕櫚酸乙酯對棗實蠅具有明顯的引誘效果[26]，棕櫚酸對薇甘菊頸盲蝽具有明顯的引誘效果[27]，同時這兩個化合物還是異遲眼蕈蚊性信息素主要成分[28]，但尚未見棕櫚酸、棕櫚酸乙酯和其他成分對鱗翅目昆蟲具有行為調節作用的報道。小白菜蒸餾水提取液中含量最高的化合物為異戊膽酸乙酯，該化合物為甾醇類物質，具有揮發性[29]，但未見其對昆蟲行為具有調節作用的報道。由此推測，9,12,15-十八碳三烯醛和9,12,15-十八碳三烯酸是小白菜蒸餾水提取液和無水乙醇提取液調節小菜蛾雌蟲行為的活性物質，其中，前者的分子質量 (262 Da) 小于后者(分子質量為278 Da)，揮發性前者強于后者，這可能是小白菜水提液對小菜蛾雌蟲的引誘活性高于小白菜乙醇提取液的原因之一。9,12,15-十八碳三烯醛和9,12,15-十八碳三烯酸是否是小菜蛾性信息素，其對小菜蛾雌蟲行為調節方式是交配還是產卵引誘，以及異戊膽酸乙酯對小菜蛾是否具有行為調節活性等，還需進一步研究。

本文基于綠色防治技術，從小菜蛾寄主植物之一的小白菜中鑒定出對小菜蛾雌蟲具有引誘效果的物質，首次在小白菜中發現了9,12,15-十八碳三烯醛具有引誘小菜蛾雌蟲的潛在活性，可用于小菜蛾綠色防控產品的開發。