固相萃取-氣相色譜-串聯質譜法測定大豆油中126 種農藥殘留

汪春明, 張 洋, 王東斌, 施鵬斐, 楊 波

(中國檢驗檢疫科學研究院 綜合檢測中心，北京 100123)

為了更有效地規范食用植物油中農藥殘留限量，聯合國糧食及農業組織 (FAO)、世界衛生組織 (WHO)、歐盟、日本、美國等國家或組織都有農藥殘留限量的規定，中國國家標準中對食用植物油中農藥殘留的限量也有明文規定[1-2]。大豆油中農藥殘留檢測之關鍵在于高含量的甘油及親脂性干擾物的存在，脂質類干擾物會在色譜柱和儀器中積聚，從而縮短色譜柱及儀器的使用壽命[3]；此外，由于離子抑制從而導致被分析物靈敏度下降，現有的檢測方法在去除油脂的同時會損耗一部分目標物。為了兼顧除去油脂和提高目標物回收率，本研究選擇增強型脂質去除產品Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱，對比傳統的固相萃取柱，以驗證其在大豆油農藥殘留分析中的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 9000-7000 氣相色譜-串聯質譜；HP-5MS UI 氣相色譜柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)(美國Agilent 公司)；SR-2DS 振蕩器 (日本TAITEC 公司)；移液槍 (德國Eppendorf 公司)；EVA50A 氮吹儀 (中國普立泰科公司)；CR21N 離心機 (日本HITACHI 公司)；VORTEX GENIE 2 渦旋混勻器 (美國Scientific Industries 公司)；XS105&PL303 分析天平 (瑞士METTLER TOLEDO公司)；VISIPREP DL 固相萃取裝置 (美國SUPELCO公司)；Milli-Q 超純水系統 (美國Millipore 公司)。

126 種農藥標準品 (見表1，純度 ≥ 95%，Dr Ehrenstorfer，德國)；正己烷、乙腈和乙酸乙酯(色譜純，美國Fisher 公司)；氯化鈉 (分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；試驗用水為Milli-Q 超純水；Agilent Bond Elut 弗羅里硅土固相萃取柱 (FL，1 g，6 mL)；Agela 中性氧化鋁固相萃取柱 (AL-N，1 g，6 mL)；Waters Oasis HLB 固相萃取柱 (150 mg，6 mL)；Agilent 增強型脂質去除固相萃取柱 (Captiva EMR-Lipid，1 g，6 mL)；Waters Oasis PRiME HLB 固相萃取柱 (60 mg，3 mL)；Waters Oasis PRiME HLB Short 固相萃取柱 (335 mg)；Supelclean 硅膠固相萃取柱 (LC-Si，1 g，6 mL)；Supelclean C18固相萃取柱 (ENVI-18，1 g，6 mL)；Agela Cleanert PEP 固相萃取柱 (200 mg，3 mL)。

試驗樣品來源：中國檢驗檢疫科學研究院綜合檢測中心樣品間。

1.2 樣品前處理

稱取5 g 樣品，以10 mL 用乙腈飽和的正己烷溶解并輕輕搖勻，加入10 mL 用正己烷飽和的乙腈，振蕩10 min 后于 -5 ℃、20 000 r/min 下離心5 min；取下層乙腈相于50 mL 離心管中，以10 mL正己烷飽和的乙腈振蕩提取10 min 后于-5 ℃、20 000 r/min 下離心5 min；合并兩次提取液，混勻；取6 mL 乙腈提取溶液，加入1.5 mL 一級水混勻，分兩次全部轉移到Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱中 (事先分別用5 mL 乙腈、5 mL 一級水活化)，Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱下接內含1.0 g氯化鈉的15 mL 離心管，當待測物流至近干后用吸耳球吹干；流出液 (約7.5 mL) 渦旋30 s，靜置分層；取4 mL 上層乙腈溶液，于40 ℃下氮氣吹至近干，用1.0 mL 乙酸乙酯復溶，待氣相色譜-串聯質譜檢測。

1.3 標準溶液配制

1.3.1 標準儲備溶液 分別準確稱取不低于10 mg各農藥標準品于10 mL 容量瓶中，用丙酮溶解并定容，得到適當濃度的標準儲備液。

1.3.2 混合標準溶液 按照農藥的性質和保留時間，將126 種農藥分為A、B 兩組，詳見表1。準確吸取合適的標準儲備液于10 mL 容量瓶中，得到10 mg/L 混合標準中間溶液，之后再逐級稀釋為1.0 mg/L 混合標準溶液。

1.3.3 基質匹配標準溶液 準確吸取適量1.0 mg/L各農藥混合標準溶液，用乙酸乙酯逐級稀釋成質量濃度為0.003、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L 的系列標準工作溶液。選擇不含目標農藥的大豆空白樣品，按1.2 步驟處理得到空白基質溶液。取1 mL 空白基質溶液用氮氣吹干，分別準確加入 1 mL 上述標準工作溶液復溶，即得到系列基質匹配混合標準工作溶液。

表1 126 種農藥保留時間及氣相色譜-串聯質譜檢測參數Table1 Retention time and GC-MS/MS detection parameters of 126 pesticides

續表 1Table1 (Continued)

續表 1Table1 (Continued)

1.4 檢測條件

氣相色譜條件：初始溫度60 ℃，保持1.0 min，以40 ℃/min 升至170 ℃不保持，以10 ℃/min 升至310 ℃保持3.0 min；進樣口溫度280 ℃；進樣量1.0 μL；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。

質譜條件：電子轟擊離子源 (EI)；電子能量70 eV；接口溫度為280 ℃；離子源溫度為280 ℃；四極桿溫度為150 ℃；溶劑延遲3.0 min；掃描模式為多反應監測 (MRM)，定量定性離子對及碰撞能量見表1。

1.5 添加回收試驗

根據《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[1]中規定油料和油脂中農藥的最大殘留限量基本在0.005 mg/kg 以上，為了更好地滿足最大殘留限量需求，本研究向大豆油中準確添加混合標準溶液的最低添加水平為0.005 mg/kg (其中113 種按0.005 mg/kg 添加，12 種按0.01 mg/kg 添加，生物芐呋菊酯按0.05 mg/kg 添加)，并分別選擇其1、2 和10 倍3 個水平添加標準混合溶液，每個水平重復6 次。按1.2 節和1.4 節的條件進行前處理和測定，計算平均回收率和相對標準偏差(RSD)。

1.6 基質效應

基質效應對氣相色譜的影響普遍存在，比較相同濃度的農藥，其在基質溶液中的色譜峰響應值會比其在純溶劑中的高。基質效應的存在，一方面可以減少熱不穩定農藥的分解，以及屏蔽進樣口的活性位點而減少農藥在活性位點的吸附，增加目標化合物從進樣口到色譜柱的濃度[4-6]；另一方面由于質譜檢測是將物質離子化，在磁場 (或電場) 作用下按離子的質荷比分離來定性和定量，在基質效應的存在下，共流出組分會改變待測物的離子化效率和離子成分的組成，進而引起待測物檢測信號的變化[7-8]，影響方法的靈敏度和檢出限，因此有必要對基質效應進行評價。本研究采用提取后加入法和絕對基質效應法評價基質效應，通過測定目標化合物在基質匹配標準溶液中的響應值 (A) 及其在純溶劑中的響應值 (B)，根據公式 (1) 計算基質效應 (Me)。當Me＜ 15 % 時，基質效應對結果的影響可忽略；當Me≥ 15% 時，基質效應對結果的影響不可忽略[9-10]。

2 結果與分析

2.1 MRM 方法的建立

2.1.1 確認保留時間及母離子 以MS1 scan 模式運行標準樣品，在MassHunter 定性分析軟件中積分并提取質譜，輔以NIST 數據庫確定目標化合物及其保留時間，選擇質量數相對更大、豐度更高的特異性離子作為母離子。

2.1.2 確認子離子及最佳碰撞能量 選擇時間片段，將質譜掃描類型改為產物離子掃描 (production)，輸入母離子、低質量數離子、高質量數離子及不同的碰撞能量后運行標準品以確定子離子和最佳碰撞能量。

2.1.3 優化峰形、確認MRM 方法 根據目標化合物的保留時間、特征離子對及最佳碰撞能量創建MRM 方法，運行混合標準樣品并記錄各化合物的峰寬，依據MRM 方法各分段的總時間，結合目標化合物的峰寬來調節每個transition 的駐留時間，確保每個化合物峰上有20 個左右的采樣點。在MassHunter 軟件中查看峰形和靈敏度，確認方法。優化后的結果見表1。大豆油中126 種農藥在動態多反應監測模式掃描下的總離子流圖見圖1。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取溶劑的選擇 農藥殘留檢測過程中常用的提取溶劑有丙酮、正己烷、乙酸乙酯、乙腈、酸化乙腈及其不同比例的混合溶劑，其中乙酸乙酯和丙酮作為提取溶劑在提取脂肪含量高的樣品時共萃取物多，增加了后續樣品凈化的難度。考慮到有些農藥在酸性環境中不穩定，導致農藥回收率降低，本研究采用不經過酸堿調節的用正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑。在提取前，先用乙腈飽和的正己烷溶解樣品，以便使溶解在乙腈中的油脂盡可能少[3]。本研究發現，在提取過程中加入氯化鈉也會使油脂分配到乙腈相的比例大大減小，但在后續應用過程中發現，有些樣品加入氯化鈉后，乙腈與正己烷不能準確分層。綜合考慮，在前處理過程去掉氯化鈉。

2.2.2 固相萃取柱的篩選 為了更好地對比不同SPE 柱除去油脂的凈化效果，本研究選取5 個大豆油空白樣品，準確稱取5 g，加入1.0 g 氯化鈉、以10 mL 用乙腈飽和的正己烷和20 mL 用正己烷飽和的乙腈，振蕩10 min，于 -5 ℃、20 000 r/min 下離心5 min。分別取這5 個樣品的乙腈層于一個潔凈容器中，混合均勻后分別準確移取其5 mL，加入至事先用10 mL 乙腈活化但不流干的FL、AL-N、HLB、PRiME-HLB、PRiME HLB Short、LC-Si、ENVI-18、PEP 和Captiva EMRLipid 固相萃取柱中；其中Captiva EMR-Lipid 使用方式與其他SPE 柱有所不同，使用前先用5 mL乙腈和5 mL水活化，在加入之前，加入1.25 mL 一級水與其混合均勻 (Captiva EMR-Lipid 柱需要有機相與水體積比為4 : 1 時，才能充分發揮Captiva EMR-Lipid 柱的功效)。凈化液接收于接收管，接收之前準確稱取接收管的質量；乙腈提取液過所有SPE 柱時采用1 滴/s，流至近干時，用吸耳球吹干殘留在固相萃取柱上的乙腈提取液；將凈化液在40 ℃水浴中，氮氣吹至近干；記錄不同接收管的質量，計算前后差值；用1.0 mL 乙酸乙酯溶解，待氣相色譜-串聯質譜測定。

結合接收管前后剩余油滴 (圖2) 和氣相色譜-串聯質譜用2.2.2 節的方法結合1.4 節的儀器條件(檢測模式改為MS1 SCAN)，對不同種類固相萃取柱凈化后空白樣品色譜圖 (圖3) 進行對比。綜合分析得知，AL-N 和Captiva EMR-Lipid 凈化效果最好。為了進一步比較AL-N 和Captiva EMR-Lipid的區別，作者對其做了添加回收試驗，添加水平為0.02 mg/kg，其中溴螨酯、鄰苯基苯酚、乙酯殺螨醇、速滅磷、丙溴磷過AL-N 柱后沒有回收或回收率低，加之Captiva EMR-Lipid 的基質響應值高于AL-N。因此選用Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱作為凈化材料。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

結果表明：在0.003～0.2 mg/L 范圍內，126 種農藥的質量濃度與其對應的峰面積之間線性關系良好，R2均大于0.995。

篩選經1.2 節前處理且信噪比低于3 的樣品作為空白，以信噪比等于或大于10 作為方法的定量限 (LOQ)，其LOQ 在0.005～0.05 mg/kg 之間。

添加回收試驗結果表明：126 種農藥的平均回收率在60%～119%之間，其中122 種農藥的RSD低于20%，另外4 種農藥的RSD 低于25%。

2.4 基質效應

結果表明：總體上表現為明顯的基質增強效應，其中：1) 氯苯胺靈和內吸磷存在基質減弱效應 (Me在-65%～16%之間)，而且隨著添加濃度的增加，減弱的基質效應逐漸變得不明顯；2) 醚菌酯在0.005 和0.01 mg/kg 添加水平下表現為基質減弱效應，在0.05 mg/kg 水平表現為基質增強效應；3) 有122 種農藥表現為明顯的基質增強效應；4) 有83 種農藥在添加水平0.05 mg/kg 的基質效應弱于0.005 和0.01 mg/kg，可見當添加濃度增加后，基質效應會相應的減弱。因此本研究采用基質匹配標準溶液進行了校正。

2.5 實際樣品測定

利用所建立的方法對企業送檢和市場隨機抽檢的15 批大豆油樣品進行了農藥多殘留檢測。結果均未檢出本方法所涉及農藥殘留的存在。

3 結論

優化了大豆油中農藥殘留的前處理方法，利用增強型脂質去除產品Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱，結合GC-MS/MS 多反應監測模式 (MRM)，建立了大豆油中126 種農藥殘留的檢測方法。結果表明：Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱能夠有效除去甘油及親脂性干擾物，大豆油脂質成分含量高，基質效應明顯，當大豆油中所含農藥質量濃度較低時基質效應越明顯，采用基質匹配標準溶液進行校正能夠使結果更加準確。運用本方法對實際樣品進行農藥多殘留檢測，并未檢出本方法所涉及農藥殘留的存在。