己唑醇及其對(duì)映體對(duì)人體乳腺癌細(xì)胞的選擇毒性及氧化損傷研究

蘭 陽, 孫大利,2, 龐俊曉, 孫曉紅

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院/環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2. 貴州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；3. 貴陽學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，貴陽 550005)

0 引言

己唑醇 (hexaconazole) 屬三唑類高效殺菌劑，因其良好的殺菌效果被廣泛應(yīng)用于水稻紋枯病、蘋果白粉病和小麥銹病等病害的防治[1-2]。但己唑醇較難降解，容易通過農(nóng)田進(jìn)入環(huán)境，進(jìn)而對(duì)人體健康造成一定程度的危害。己唑醇具有一個(gè)手性中心，存在兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體，屬于手性農(nóng)藥。農(nóng)藥對(duì)映異構(gòu)體 (以下簡稱對(duì)映體)在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化、降解以及在生物體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)移、代謝、分布和排泄過程中均可表現(xiàn)出不同的行為，從而導(dǎo)致其具有不同的環(huán)境行為、生物活性及毒性作用[3-4]。例如，R-丙溴磷對(duì)小鼠的毒性大于S-丙溴磷，但對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的影響則相反[5]。因此，只有在對(duì)映體水平上研究其所引起的環(huán)境行為和毒性才能更全面地評(píng)估手性農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境及人類健康所帶來的風(fēng)險(xiǎn)。閆冬艷[6]研究了吡噻菌胺和丙硫菌唑兩種新型手性農(nóng)藥對(duì)HepG2細(xì)胞的對(duì)映體選擇性毒性，得出細(xì)胞毒性機(jī)制為吡噻菌胺峰1＞吡噻菌胺峰2＞吡噻菌胺外消旋體以及丙硫菌唑峰2＞丙硫菌唑外消旋體＞丙硫菌唑峰1 的研究結(jié)果。楊桂玲等[7]明確了 8 種農(nóng)藥多殘留組合對(duì)HepG2 人肝癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，在所測(cè)定的 22 個(gè)農(nóng)藥組合中，大多數(shù)組合的劑量-效應(yīng)關(guān)系基本符合傳統(tǒng)的毒理學(xué)劑量-效應(yīng)曲線關(guān)系，證實(shí)了農(nóng)藥多殘留在較低的劑量下即有可能產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用。

相關(guān)研究表明，己唑醇對(duì)映體在不同生物體內(nèi)所引起的毒性存在差異性，甚至毒性作用完全相反[8]。有關(guān)己唑醇在兔子[9]、黃瓜[10]、大型溞及斑馬魚[11]等動(dòng)植物體內(nèi)的立體選擇性研究已有報(bào)道，但其對(duì)人體細(xì)胞的選擇性毒性研究尚未見報(bào)道。己唑醇已被歐盟 (EU) 和世界自然基金組織 (WWF)列為具有生殖和內(nèi)分泌干擾毒性的化合物之一[12]。人體乳腺癌細(xì)胞MCF-7 具有容易獲得、在實(shí)驗(yàn)室條件下容易培養(yǎng)繁殖、培養(yǎng)成本低、對(duì)已唑醇毒性比較敏感以及發(fā)育成熟期短等優(yōu)勢(shì)。農(nóng)藥對(duì)生物體或細(xì)胞造成的毒性損傷通常與ROS 的形成有關(guān)[13-14]，一旦接觸到污染物，生物或細(xì)胞就會(huì)建立防御系統(tǒng)，之后通過酶和非酶抗氧化劑來消除損害。活性氧(ROS)的形成可影響超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 和過氧化氫酶 (catalase,CAT) 的活性，從而誘導(dǎo)氧化損傷[15-16]。因此，氧化應(yīng)激被廣泛用于研究污染物對(duì)生物體或細(xì)胞的毒性[17-19]。

為了明確己唑醇對(duì)映體的選擇性毒性及其作用機(jī)制，本研究以MCF-7 作為體外模型，從對(duì)映體水平上研究了細(xì)胞活力及氧化應(yīng)激性存在的差異，旨在對(duì)映體層面開展己唑醇的研究，并深入研究對(duì)映體的選擇性毒性及其作用機(jī)制，以便為由已唑醇引起的環(huán)境行為和毒性效應(yīng)做出更全面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為篩選高效且生物低毒的對(duì)映體單體提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

人體乳腺癌MCF-7 細(xì)胞由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供。rac-己唑醇 (外消旋體) 標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.0%，購自Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司 (Augsberg，德國)。(+)-己唑醇和 (-)-己唑醇純光學(xué)對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.0%，購自上海勤路生物技術(shù)有限公司。Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 試劑盒購自DOJINDO 公司 (日本熊本)。乳酸脫氫酶 (LDH)、活性氧 (ROS)、超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT) 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 高糖培養(yǎng)基、胰酶消化液和青霉素-鏈霉素購自加拿大Wisent Biotechnology 公司。胎牛血清 (FBS) 購自杭州四季青生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

BPN—50CH 二氧化碳培養(yǎng)箱 (上海一恒，中國)；超凈工作臺(tái) (蘇州金凈，中國)；SYNERGY H4 型熒光多功能酶標(biāo)儀 (Bio TeK，美國)；CKX31倒置生物顯微鏡 (Olympus，日本)；1510 型酶標(biāo)儀 (Thermo Fisher，美國)；液氮儲(chǔ)存罐 (東亞YDS SOB)；AUW120D 型分析天平 (Shimadzu，日本)；移液槍 (Eppendorf，德國)；TG20K 高速冷凍離心機(jī) (上海舜制儀器制造有限公司，中國)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品前處理 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品前處理參照孫大利報(bào)道的方法[20]。細(xì)胞培養(yǎng)液為含10% FBS 和1%青霉素鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)液每2 d 更換1 次。細(xì)胞置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了測(cè)定己唑醇對(duì)映體對(duì)MCF-7 細(xì)胞的毒性及氧化損傷情況，將濃度約為5 × 104cells/mL 的細(xì)胞懸浮液分別加入24 孔板或96 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用含不同質(zhì)量濃度rac-、(+)-和 (-)-己唑醇的DMEM 培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液，進(jìn)行染毒試驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞活性測(cè)定 取上述含有MCF-7 細(xì)胞的懸浮液 (濃度約為5 × 104cells/mL) 100 μL，加入96 孔板中培養(yǎng)24 h；移去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次。分別加入110 μL 含有10、20、40、80和160 mg/L rac-、(+)-和 (-)-己唑醇的DMEM 培養(yǎng)液。同時(shí)設(shè)空白組和對(duì)照組。空白組為100 μL D E M E 培養(yǎng)液(無細(xì)胞)；對(duì)照組為1 0 0 μ L DMEM 培養(yǎng)液和細(xì)胞。每濃度或空白重復(fù)3 次。將加樣后的96 孔板置于培養(yǎng)箱中染毒24 h。參照試劑盒說明書，向每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育1 h，使得CCK-8 還原為甲瓚。采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長450 nm 下的吸光度。

1.3.3 細(xì)胞氧化損傷的測(cè)定

1.3.3.1 LDH 釋放量的測(cè)定 將MCF-7 細(xì)胞 (濃度約為5 × 104cells/mL) 在24 孔板中培養(yǎng)24 h，移去細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入含有20、40 和80 mg/L rac-、(+)-和 (-)-己唑醇的DMEM 培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中暴露24 h。每濃度重復(fù)3 次。根據(jù)試劑盒中提供的檢測(cè)方法 (表1)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長440 nm下的熒光吸收值，計(jì)算細(xì)胞釋放的LDH 含量。

表1 各處理組乳酸鹽脫氫酶 (LDH) 活性測(cè)定反應(yīng)體系Table1 The reaction system of LDH activity measurement in each treatment group (μL)

1.3.3.2 ROS 含量測(cè)定 將細(xì)胞 (濃度約為5 × 104cells/mL) 在96 孔板中培養(yǎng)24 h，移去細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入含有20、40 和80 mg/L rac-、(+)- 和(-)-己唑醇的DMEM 培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中暴露24 h。除去染毒培養(yǎng)液，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組及陽性對(duì)照組。空白對(duì)照組以細(xì)胞培養(yǎng)液代替染毒培養(yǎng)液。活性氧陽性對(duì)照(ROSup) 組以稀釋后的陽性對(duì)照液 (無酚紅DMEM 以體積比1 : 1 000 稀釋) 代替細(xì)胞培養(yǎng)液。DCF-DA 溶液用無酚紅DMEM 以體積比為1 : 1 000 的比例稀釋，配成工作液。向每孔中加入100 μL 稀釋后的DCFH-DA 工作液，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min 后棄去上層液體，用無酚紅DMEM 洗滌細(xì)胞3 次，除去未進(jìn)入細(xì)胞的DCFHDA。最后，向每孔加入100 μL PBS。每濃度處理重復(fù)3 次。在酶標(biāo)儀下，以485 nm 為激發(fā)波長、525 nm 為發(fā)射波長，測(cè)定熒光值。

1.3.3.3 SOD 及CAT 酶活性測(cè)定 為了檢測(cè)細(xì)胞中SOD 和CAT 酶活性，向24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入2 mL 濃度為5 × 104cells/mL 的細(xì)胞懸浮液。培養(yǎng)24 h 后，分別用含有20、40 和80 mg/L rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇的DMEM 培養(yǎng)液替換原細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。每處理重復(fù)3 次。染毒24 h 后，棄去上層培養(yǎng)液，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次。每孔加入300 μL 細(xì)胞裂解液，裂解30 min后用微量移液器吸出，待測(cè)。按照試劑盒中的檢測(cè)方法(表2 和表3)。分別向5 mL 離心管中依次加入表中試劑，每濃度重復(fù)3 次，混合均勻后，室溫靜置10 min。分別在550 nm 及405 nm 的熒光波長下測(cè)定SOD 酶及CAT 酶活性。

表2 各處理組細(xì)胞內(nèi)SOD 活性測(cè)定反應(yīng)體系Table2 The reaction system of SOD activity measurement in each treatment group (μL)

表3 各處理組細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶 (CAT) 活性測(cè)定反應(yīng)體系Table3 The reaction system of CAT activity measurement in each treatment group (mL)

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有處理均設(shè)置3 個(gè)平行，數(shù)據(jù)以Mean ±SD 表示。全部數(shù)據(jù)利用軟件SPSS17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較，若方差齊時(shí)，采用Student-Newman-Keuls 檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用Tamhane’s 檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。* 表示單個(gè)對(duì)映體或者外消旋體與對(duì)照組之間存在顯著性差異 (P ＜ 0.05)。相同字母代表對(duì)映體之間或者對(duì)映體與外消旋體之間不存在顯著性差異，不同字母則代表二者之間存在顯著性差異 (P ＜ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 己唑醇及其對(duì)映體處理對(duì)MCF-7 細(xì)胞形態(tài)的影響

不同濃度的己唑醇暴露24 h 后，3 種結(jié)構(gòu)形式的己唑醇對(duì)MCF-7 細(xì)胞形態(tài)均有不同程度的破壞。隨著暴露濃度增加，細(xì)胞形態(tài)損傷越發(fā)嚴(yán)重，可見細(xì)胞形態(tài)損傷程度與已唑醇暴露濃度呈正相關(guān)。

圖1 為空白對(duì)照及20、40 和80 mg/L 的rac-己唑醇處理后MCF-7 細(xì)胞形態(tài)變化情況。空白對(duì)照組的細(xì)胞貼壁生長良好，細(xì)胞形態(tài)完整，幾乎覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿 (圖1A)；當(dāng)培養(yǎng)液中rac-己唑醇的質(zhì)量濃度為20 mg/L 時(shí)，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞狀態(tài)良好，但體積有一定增大；當(dāng)其質(zhì)量濃度增加到40 mg/L 時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)損傷，體積增大，細(xì)胞數(shù)量開始減少，死亡細(xì)胞失去黏性漂浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞形態(tài)不再是正常的菱形；當(dāng)其質(zhì)量濃度增加到80 mg/L 時(shí)，細(xì)胞受到損傷，很難觀察到狀態(tài)良好的細(xì)胞，大量的細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中，說明在此濃度下，rac-己唑醇對(duì)MCF-7 細(xì)胞造成了損傷。

圖2 為空白對(duì)照、20、40 和80 mg/L 的 (+)-己唑醇處理后MCF-7 細(xì)胞形態(tài)的變化。不含己唑醇的細(xì)胞貼壁生長良好，幾乎覆蓋了整個(gè)培養(yǎng)皿；當(dāng) (+)-己唑醇質(zhì)量濃度為20 mg/L 時(shí)，少量細(xì)胞開始增大，鏡下可見少量亮斑，說明在此濃度下，(+)-己唑醇對(duì)細(xì)胞形態(tài)有一定影響；當(dāng) (+)-己唑醇增加到40 mg/L 時(shí)，細(xì)胞黏性減弱，半數(shù)細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞形態(tài)不能維持正常的菱形；當(dāng) (+)-己唑醇質(zhì)量濃度增加到80 mg/L 時(shí)，細(xì)胞開始溶解，鏡下觀察不到貼壁的正常細(xì)胞，幾乎全部漂浮于培養(yǎng)液中，說明在此濃度下 (+)-己唑醇對(duì)MCF-7 細(xì)胞造成了損傷。

圖3 為空白對(duì)照組及經(jīng)20、40、80 mg/L 的(-)-己唑醇處理后MCF-7 細(xì)胞形態(tài)的變化。空白組的細(xì)胞貼壁生長良好，幾乎覆蓋了整個(gè)培養(yǎng)皿；當(dāng) (-)-己唑醇的質(zhì)量濃度為20 mg/L 時(shí)，細(xì)胞體積開始增大，鏡下可見少量細(xì)胞浮漂于培養(yǎng)液中；當(dāng) (-)-己唑醇增加到40 mg/L 時(shí)，大量細(xì)胞形態(tài)被改變，細(xì)胞數(shù)量大幅減少，半數(shù)細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中；當(dāng) (-)-己唑醇增加到80 mg/L 時(shí)，細(xì)胞開始溶解，細(xì)胞數(shù)量急劇減少，幾乎全部漂浮于培養(yǎng)液中，說明在此質(zhì)量濃度下，(-)-己唑醇對(duì)MCF-7 細(xì)胞造成了較大的損傷。

2.2 己唑醇對(duì)MCF-7 的細(xì)胞毒性

在本研究中，采用CCK-8 法測(cè)定了己唑醇及其對(duì)映體對(duì)MCF-7 細(xì)胞活性的影響。如圖4 所示，當(dāng)己唑醇從10 mg/L 增加到160 mg/L 時(shí)，細(xì)胞活性急劇下降。細(xì)胞活性與藥劑質(zhì)量濃度間呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。在10 mg/L 時(shí)，rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理24 h 后的MCF-7 細(xì)胞活性分別為103.87%、87.11%和85.24%。與空白組相比，經(jīng)rac-己唑醇處理后細(xì)胞活性無顯著性差異，(+)- 和 (-)-己唑醇存在顯著性差異 (P ＜0.05)。3 種形式的己唑醇之間，(+)- 和 (-)-己唑醇處理后的MCF-7 細(xì)胞活性無顯著性差異，但與rac-己唑醇相比，均存在顯著性差異 (P ＜ 0.05)。當(dāng)其質(zhì)量濃度增加至40 mg/L 時(shí)，MCF-7 的細(xì)胞活性明顯下降，rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后的細(xì)胞活性分別降為81.05%、68.08%和60.78%，并且經(jīng)3 種形式的己唑醇處理后MCF-7 細(xì)胞活性均表現(xiàn)出顯著性差異 (P ＜ 0.05)。MCF-7 細(xì)胞對(duì)于(-)-己唑醇最為敏感。當(dāng)質(zhì)量濃度分別為80 和160 mg/L 時(shí)，與空白組相比，rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后MCF-7 細(xì)胞存活率分別降低至9.37%、8.92% 和5.73%，5.24%、5.11%和4.07%。與空白組相比，3 種形式的己唑醇處理對(duì)MCF-7 細(xì)胞活性的影響均存在極顯著性差異 (P ＜ 0.01)。3 種形式的己唑醇，對(duì)MCF-7 細(xì)胞活性的影響無顯著性差異。結(jié)果表明，在設(shè)置劑量下，(-)-己唑醇對(duì)MCF-7 細(xì)胞活性抑制率最高，其次為 (+)-己唑醇和rac-己唑醇。

2.3 己唑醇對(duì)MCF-7 細(xì)胞氧化損傷的影響

2.3.1 對(duì)LDH 釋放量的影響 細(xì)胞內(nèi)LDH 的釋放量通常被認(rèn)為是細(xì)胞膜損傷程度的標(biāo)志。如圖5 所示，經(jīng)過不同濃度的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后，細(xì)胞外LDH 的含量與空白對(duì)照相比顯著增加 (P ＜ 0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/L 時(shí)，經(jīng)過rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇暴露后，釋放到細(xì)胞外的LDH 含量分別是空白對(duì)照組的1.45、1.61和1.64 倍。經(jīng) (-)-己唑醇處理后細(xì)胞液中LDH 的相對(duì)含量比經(jīng)rac- 和 (+)-己唑醇處理后的顯著增加 (P ＜ 0.05)；在40 mg/L 時(shí)，釋放到細(xì)胞外的LDH 含量分別是空白對(duì)照組的1.45、1.61 和1.64 倍，經(jīng) (-)- 和 (+)-己唑醇處理后細(xì)胞液中的LDH 相對(duì)含量比經(jīng)rac-己唑醇處理后的顯著增加(P ＜ 0.05)；當(dāng)質(zhì)量濃度為80 mg/L 時(shí)，細(xì)胞外的LDH 含量分別是空白對(duì)照組的1.62、1.88 和1.87 倍，經(jīng) (-)- 和 (+)-己唑醇處理后的細(xì)胞液中的LDH 相對(duì)含量比經(jīng)rac-己唑醇處理后的顯著增加 (P ＜ 0.05)。結(jié)果表明，在設(shè)置劑量下，3 種形式的己唑醇對(duì)MCF-7 細(xì)胞膜損傷程度大小為 (-)-己唑醇＞(+)-己唑醇＞rac-己唑醇。

2.3.2 對(duì)ROS 生成的影響 如圖6 所示，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后，MCF-7 細(xì)胞內(nèi)ROS 釋放量隨著藥劑質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)，即呈“倒U”情況。經(jīng)20 mg/L 的 (-)-、(+)- 和rac-己唑醇處理，細(xì)胞內(nèi)ROS 的相對(duì)含量分別為空白組的4.11、4.04 和3.56 倍，ROS 釋放量顯著增加 (P ＜ 0.05)，3 種形式的己唑醇之間沒有顯著性差異；經(jīng)40 mg/L 的(-)-、(+)- 和rac-己唑醇處理，細(xì)胞內(nèi)ROS 的相對(duì)含量分別為空白對(duì)照組的2 0.4 2、1 9.7 6 和19.08 倍，顯著增加 (P ＜ 0.05)。值得注意的是，經(jīng)80 mg/L 的 (-)-、(+)- 和rac-己唑醇處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS 的相對(duì)含量為空白組的2.97、2.97 和2.16 倍。細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生量與己唑醇質(zhì)量濃度為40 mg/L 時(shí)相比顯著降低，這可能是由于在此濃度下酶活性的增加量不足以清除高濃度己唑醇對(duì)細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致適應(yīng)性機(jī)制的喪失[21]。

2.3.3 對(duì)SOD 酶活性的影響 如圖7 所示，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后，MCF-7 細(xì)胞內(nèi)SOD 酶活性隨著藥劑質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先升高再下降趨勢(shì)。經(jīng)20 mg/L 的己唑醇暴露24 h 后，rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后細(xì)胞內(nèi)SOD 酶活性分別為對(duì)照的1.02，1.04 和1.04 倍，與空白組相比無顯著性差異；3 種形式的己唑醇之間也無顯著性差異。與空白組相比，經(jīng)40 mg/L 的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后，細(xì)胞內(nèi)SOD 酶活性分別增加1.22、1.27 和1.50 倍，均呈現(xiàn)出顯著性差異 (P ＜ 0.05)；3 種形式的己唑醇之間也呈現(xiàn)出顯著性差異 (P ＜ 0.05)。其中，由(-)-己唑醇處理所引起的SOD 酶活性增長值最高，其次是 (+)-己唑醇和rac-己唑醇。然而，當(dāng)其質(zhì)量濃度為80 mg/L 時(shí)，與空白組相比，rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后細(xì)胞內(nèi)SOD 酶活性分別降低至0.61、0.54 和0.53 倍。這可能是因?yàn)镾OD 可將ROS 轉(zhuǎn)化為H2O2，過量的ROS 已經(jīng)超出了SOD 的轉(zhuǎn)化能力，SOD 酶的氨基酸側(cè)鏈被氧化，進(jìn)而失去了部分功能[22]。

2.3.4 對(duì)CAT 酶活性的影響 由圖8 所示，與空白組相比，經(jīng)過不同質(zhì)量濃度己唑醇處理后，細(xì)胞內(nèi)CAT 酶活性隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加，己唑醇對(duì)MCF-7 細(xì)胞中CAT 酶活性存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)己唑醇質(zhì)量濃度為20 mg/L 時(shí)，3 種形式的己唑醇處理后CAT 酶活性分別是空白組的1.13、1.18 和1.23倍，差異顯著 (P ＜ 0.05)，且3 種形式的己唑醇間也呈現(xiàn)出顯著性差異 (P ＜0.05)；當(dāng)其質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，3 種處理的CAT 酶活性分別是空白組的1.26、1.45 和1.46倍，其中 (-)- 和 (+)-己唑醇處理后細(xì)胞內(nèi)CAT 酶活性顯著高于rac-己唑醇 (P ＜ 0.05)；而在80 mg/L時(shí)，CAT 酶活性分別提高到1.58、1.61 和1.65倍，(-)-己唑醇處理后細(xì)胞內(nèi)CAT 酶活性顯著高于 (+)- 和rac-己唑醇 (P ＜ 0.05)。由此可見，在相同質(zhì)量濃度下，(-)-己唑醇處理后細(xì)胞內(nèi)CAT 酶活性最高，其次是 (+)-己唑醇和rac-己唑醇。

3 結(jié)論與討論

本研究以MCF-7 細(xì)胞為受試對(duì)象，分別用10～160 mg/L 5 個(gè)質(zhì)量濃度的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇染毒24 h 后，測(cè)得MCF-7 細(xì)胞活性分別從85.24%、87.11%和103.87%降至4.07%、5.11%和5.24%。由此可見，(-)-己唑醇對(duì)MCF-7 細(xì)胞活性的抑制率最高，其次為 (+)-己唑醇和rac-己唑醇。梁宏斌[11]從對(duì)映體水平上開展了己唑醇對(duì)大型溞及斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果表明，己唑醇對(duì)映體對(duì)大型溞和斑馬魚的急性毒性結(jié)果較為一致，均是 (-)-己唑醇＞rac-己唑醇＞(+)-己唑醇。對(duì)斑馬魚的胚胎-魚仔發(fā)育影響試驗(yàn)以及魚仔活動(dòng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)映體之間均存在毒性差異性，其結(jié)果與急性毒性試驗(yàn)結(jié)果相一致。總體來說，(-)-己唑醇對(duì)生物的毒性最高，但在不同生物體內(nèi)(+)-己唑醇與rac-己唑醇的毒性有所差異。這也與己唑醇不同對(duì)映體在不同生物體內(nèi)所引起的毒性存在差異性，甚至毒性作用完全相反的結(jié)論相符。

氧化損傷檢測(cè)結(jié)果顯示，MCF-7 細(xì)胞經(jīng)20、40 和80 mg/L 的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇暴露后，隨著己唑醇質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)LDH 釋放量升高，CAT 活性增強(qiáng)，但ROS 產(chǎn)生量和SOD 酶活性呈現(xiàn)“倒U”趨勢(shì)，這與其他手性農(nóng)藥在MCF-7細(xì)胞研究中得到的結(jié)論有所不同。孫大利[20]從對(duì)映體水平上開展了乙螨唑?qū)CF-7 細(xì)胞的選擇性毒性研究。結(jié)果表明，經(jīng)過不同濃度的乙螨唑?qū)τ丑w處理后，MCF-7 細(xì)胞中與氧化應(yīng)激相關(guān)的如LDH 釋放量、ROS 含量以及與抗氧化活性有關(guān)的SOD 酶和CAT 酶活性均增加。這可能是因?yàn)樵诟邼舛认旅富钚缘脑黾恿坎蛔阋郧宄邼舛燃哼虼紝?duì)細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致適應(yīng)性機(jī)制的喪失[22]。近年來也有報(bào)道指出，外源化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)分泌干擾作用并非呈現(xiàn)簡單的上升或下降趨勢(shì)，而可能出現(xiàn)“U”或者“倒U”等情況[23]。該結(jié)果提示，高濃度的己唑醇可能與細(xì)胞內(nèi)分泌功能相關(guān)的通路或受體等有關(guān)聯(lián)。根據(jù)本研究的結(jié)果，己唑醇誘導(dǎo)的毒性和氧化損傷的模式可能是：己唑醇處理增加了細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量水平，觸發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激，改變了抗氧化酶活性。對(duì)于己唑醇誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞選擇性毒性的分子機(jī)制則需進(jìn)一步研究。

手性農(nóng)藥約占全球農(nóng)藥市場的35%，并且市售手性農(nóng)藥中很大部分以外消旋體的形式存在，而絕大多數(shù)手性農(nóng)藥的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是將外消旋體作為單一物質(zhì)來進(jìn)行的[6]。已有研究表明，手性農(nóng)藥的不同對(duì)映異構(gòu)體在與生物體相互作用時(shí)會(huì)表現(xiàn)出顯著性差異，不同對(duì)映異構(gòu)體在自然界中的遷移轉(zhuǎn)化等過程具有不同的生理、生化和毒性作用[24-25]。相關(guān)研究表明，己唑醇具有內(nèi)分泌毒性，MCF-7 作為人體內(nèi)分泌腺細(xì)胞對(duì)己唑醇的毒性反應(yīng)較明顯且直接，便于觀察研究。本研究在對(duì)映體水平上探明了己唑醇對(duì)MCF-7 細(xì)胞的選擇毒性及氧化損傷，為研究己唑醇的細(xì)胞毒性機(jī)制和開展手性單體的開發(fā)利用、減少外消旋體帶來的環(huán)境污染提供了科學(xué)依據(jù)。