抗噻蟲嗪重組全長抗體的制備與特異性識別機制研究

劉鵬琰, 郭源昊, 焦沙沙, 陳 陽, 郭逸蓉, 朱國念

(浙江大學 農藥與環境毒理研究所，杭州 310058)

噻蟲嗪屬第2 代氯代煙堿類新型殺蟲劑，因其具有對害蟲高活性、對環境低毒、殺蟲譜廣、作用速度快和持效期長等特點被廣泛使用[1]。然而近期有研究表明，非致死劑量的噻蟲嗪會影響覓食蜂的存活率，進而存在導致蜜蜂種群衰落的風險[2]；歐盟于2013 年已禁止其在除溫室大棚內的室外使用。因此，有必要建立可用于農產品和環境樣品中噻蟲嗪殘留的快速檢測技術。

與儀器法相比，基于抗原抗體間特異性和親和力結合反應的免疫分析技術，因具有反應快速、操作簡單、信號靈敏和低成本的優點而廣泛應用于農產品中農藥殘留的現場篩查和樣本的高通量快速檢測[3–5]。已有研究者報道了基于單克隆抗體(mAb) 和多克隆抗體 (pAb) 建立的酶聯免疫吸附分析 (ELISA) 方法用于噻蟲嗪的殘留檢測[1,5-7]。但無論是由雜交瘤分泌的單克隆抗體還是由血清純化獲得的多克隆抗體，都存在局限性，從而制約其長期使用，如抗體批次間的特異性和靈敏度有顯著差異，雜交瘤長期培養過程中存在抗體基因突變以及細胞株丟失的損失[8]?；诳贵w重鏈和輕鏈可變區 (VH 和VL) 序列，采用分子生物學技術制備的基因工程抗體 (又稱重組抗體)，因批間活性穩定、制備方法簡單快速經濟、遵循動物福利法而逐漸受到青睞[4,9]。而且，重組抗體經由合適的表達系統可源源不斷的產生，而不必依賴于動物體或細胞株，從而使抗體真正“永生化”。此外，重組抗體種類多樣，具備多功能或特異性抗體改造的可編輯性[10]。現在已有多種形式的重組抗體被開發并成功應用于多個農藥小分子殘留的快速檢測中，也有部分有關農藥抗體的識別機制解析研究。例如：Emma 等構建了重組單鏈抗體片段 (scFv)，用于四氟醚唑殘留的免疫分析[11]；Chen 等制備了重組抗原結合片段 (Fab)，用于O,O-二乙基有機磷類農藥殘留的免疫分析[8]。

采用計算方法的同源建模和分子對接技術，是用于解析抗體與小分子化學農藥之間分子識別機制的有力工具。Wang 等[12]利用分子對接方法，研究了重組ScFv 和12 種氟喹諾酮類藥物的識別機制，并通過定點突變優化了結合親和力，使得檢測靈敏度提高7 倍。Zhang 等[13]研究了重組Fab 與黃曲霉毒素B1 間的相互作用，指出氫鍵、π-烷基作用力、范德華力和靜電作用對識別反應有重要作用，并明確了結合過程中參與形成主要作用力的關鍵氨基酸殘基。Kusharyoto 等[14]利用分子模擬和對接，構建了莠去津特異性Fab 的三維模型，明確了半抗原的特異性結合口袋，并定位了決定親和力的關鍵氨基酸。Zhang 等[15]通過計算機同源建模構建了重組抗體的3D 結構，并與甲萘威進行分子對接，進而獲得了復合體的空間結構，鑒定出結合口袋的關鍵氨基酸，有助于了解抗甲萘威抗體與農藥的相互作用機制。

本研究基于前期獲得的抗噻蟲嗪單克隆抗體，采用亞型特異性引物序列擴增重鏈可變區和輕鏈可變區，并制備了重組全長抗體，對其特異性和靈敏度與親本抗體進行了比較；進一步根據正確的噻蟲嗪抗體可變區序列，采用同源建模和分子對接技術，初步解析了該抗體特異性識別噻蟲嗪的分子機制。該研究對小分子抗體庫構建、抗體親和力成熟以及識別譜改造具有指導意義，并有助于促進免疫分析方法在農藥殘留快速檢測中的發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要儀器

噻蟲嗪mAb-E7E2 (重鏈為IgG1，輕鏈為κ 亞型) 為實驗室前期制備，噻蟲嗪和其他煙堿類農藥標準品(德國Dr. Ehrenstorfer 公司)；氨基偶聯試劑盒(美國GE Healthcare 公司)；RNeasy? Plus Mini Kit (德國QIAGEN 公司)；分子克隆試劑(北京全式金生物公司)；表達載體pCDNA3.4-Mouse-IgG1CH 以及pCDNA3.4-Mouse-Cκ 和哺乳動物細胞HEK 293 (F)(江蘇百英生物科技有限公司)。

Biacore T200 型表面等離子共振生物分子互作分析儀 (瑞典GE Healthcare 公司)；ALS 1 296 型PCR 儀、PowerPac Basic 型核酸水平電泳儀和Mini-PROTEAN Tetra Cell 型蛋白垂直電泳儀 (美國Bio Rad 公司)；MCO-18AIC 型二氧化碳細胞培養箱 (日本Panasonic 公司)；Molecular Operating Environment 2018.01 版 (加拿大Chemical Computing Group 公司，中國中山大學劉志紅博士提供建模軟件和北京中大唯信科技有限公司提供計算咨詢)，ChemBioDraw 2014。

1.2 采用表面等離子共振 (SPR) 技術鑒定抗噻蟲嗪單克隆抗體的選擇性以及親和力和動力學特征

1.2.1 抗體固定 采用氨基偶聯試劑盒將腹水抗體經共價結合反應偶聯在羧甲基葡聚糖表面基質CM7 (Carboxymethyl dextran surface matrix 7) 芯片的通道2[16]。將pH 8.5 的乙醇胺流經芯片被活化的通道1 和偶聯有抗體的通道2，以此封閉芯片表面激活但未結合抗體的基團，來矯正可能產生的非特異性吸附。通道1 在試驗過程中作為參比通道。

1.2.2 結合選擇性考察 采用8 種新煙堿類農藥(100 μg/mL 噻蟲嗪、噻蟲胺、呋蟲胺、吡蟲啉、氯噻啉、烯啶蟲胺、啶蟲脒和噻蟲啉的甲醇溶液標準品) 進行抗體的結合選擇性考察，并以2 個有機磷類農藥 (100 μg/mL 三唑磷、毒死蜱的甲醇溶液標準品) 作為陰性對照，用運行緩沖液HBSEP+ (0.01 mol/L HEPES，pH 7.4, 含0.15 mol/L NaCl, 0.003 mol/L EDTA 和體積分數為0.05%的表面活性劑P20) 稀釋至50 nmol/L 的藥液；然后，將50 nmol/L 的8 種新煙堿類農藥和2 種有機磷類農藥的溶液分別以30 μL/min 的流速依次流經串聯的參比通道和處理通道[17]。每個樣品經過60 s 的結合反應后進行芯片表面再生。選擇2 mmol/L 的氫氧化鈉以30 μL/min 的流速流經芯片30 s 作為再生條件，并運用到后續試驗中。

1.2.3 多循環動力學測試 將篩選出的有結合活性的噻蟲嗪和噻蟲胺標準品用HBS-EP+ 進行系列梯度稀釋。噻蟲嗪標準溶液的濃度分別為：2.5、0.625、0.156 3、0.039 1、0.009 8、0 nmol/L；噻蟲胺標準溶液的濃度分別為：20、10、5、2.5、1.25、0 nmol/L。其中0 nmol/L 是只含有HBS-EP+ 緩沖液的空白樣品。噻蟲嗪和噻蟲胺的系列濃度梯度溶液由0 開始，從低濃度到高濃度依次進樣。每個循環的結合反應流速為30 μL/min，進樣120 s并伴隨著600 s 的自然解離反應[18]；然后采用2 mmol/L 氫氧化鈉以30 μL/min 的流速流經芯片30 s 進行芯片再生。

1.2.4 數據處理 采用BIA 數據處理軟件3.0 對研究結果進行分析，各樣品的信號響應值均在進行參比通道和空白樣品的雙扣減處理后按照fit local 模型進行1 : 1 kinetics/affinity 擬合分析，獲得結合速率常數 (Ka)、解離速率常數 (Kd) 和解離平衡常數 (KD)[16]。

1.3 采用亞型特異且高保守引物擴增單克隆抗體可變區序列

收集可分泌上述高特異、高親和力單克隆抗體的噻蟲嗪-E7E2 雜交瘤細胞106～107個，采用RNeasy? Plus Mini Kit 提取細胞總RNA，并反轉錄合成cDNA。使用具有亞型特異性且相對保守的引物 (表1) PCR 擴增單克隆抗體可變區片段，并進行Sanger 測序，其中上游引物位于可變區前的信號肽部位，下游引物位于可變區之后的恒定區。測得的基因序列經IMGT (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/input) 進行分析。由基因序列翻譯得到的各氨基酸序列，采用kabat 標準經abYsis (http://www.abysis.org) 劃分各框架區 (FR) 及高變區(CDR)，并經NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 做蛋白序列比對。

表1 亞型特異性引物用于擴增重/輕鏈可變區基因序列Table1 Subtype-specific primers used to amplify the VH andVL gene sequences

1.4 重組表達載體構建

以含有成功鑒定到的VH 和VL 序列的克隆載體為模板，PCR 擴增帶有表達載體同源臂的VH和VL 片段。將包含重鏈和κ 輕鏈恒定區基因序列的空載體pCDNA3.4-Mouse-IgG1CH/Cκ 經HindIII 和EcoRI 雙酶切處理。采用Gibson 無縫克隆將VH 與VL 片段與相應表達載體進行同源重組反應，進而構建重組表達載體[19]。送測序鑒定正確的重組質粒。選擇重組質粒構建成功的克隆進行擴大培養，并進行去內毒素的質粒抽提。

1.5 哺乳動物細胞瞬時表達全長重組抗體

選取每毫升含1.5 × 106個的HEK 293 (F) 細胞懸浮培養2 h，將重鏈質粒、輕鏈質粒和轉染試劑按照一定的比例混勻，37 ℃靜置孵育15 min 后，轉染HEK 293(F) 細胞，于120 r/min、8% CO2及37 ℃下懸浮培養[20]。轉染后的細胞懸浮培養至存活率低于70%后，于4 000 r/min 離心5 min，收集上清液，采用Protein A 親和層析柱純化上清液中全長重組抗體，并進行SDS-PAGE 驗證。

1.6 全長重組抗體以及親本抗體識別活性一致性鑒定

采用ic-ELISA 評價親本單克隆抗體和全長重組抗體的特異性及識別靈敏度。在96 孔ELISA 板中，每孔加入100 μL 噻蟲嗪-OVA (用于全長重組抗體測定時質量濃度為0.078 mg/L；用于親本抗體測定時質量濃度2.5 mg/L)，于4 ℃下包被過夜。次日，用PBST 洗滌96 孔ELISA 板3 次，并加入300 μL 2% (m/V) 的脫脂奶粉-PBS 進行封閉，用PBST 洗滌96 孔ELISA 板2 次后，每孔加入50 μL 系列濃度梯度的分析物標準溶液和50 μL 由2%脫脂奶粉-PBS 稀釋的抗體 (全長重組抗體：0.031 mg/L；親本抗體：0.197 mg/L)，37 ℃反應1 h。后續步驟可參考已發表文獻[18]。采用Origin 2017 軟件，以分析物濃度的對數值為橫坐標，抑制率為縱坐標，采用四參數Logistic 擬合算法制作標準曲線。計算單克隆抗體對各化合物的IC20、IC50和IC80值 (抑制率分別達到20%、50%和80%時所對應的藥劑濃度)。定義IC50值為識別靈敏度，IC20～IC80為識別線性范圍。按公式(1)計算抗體對其他結構類似物的交叉反應率：

其中：CR 為交叉反應率 (cross-reactivity，%)；A 為目標分析物的半抑制濃度 (IC50，μg/L)；B 為結構類似物的半抑制濃度 (IC50，μg/L)。

1.7 抗噻蟲嗪抗體可變區序列同源建模及分子對接

1.7.1 模型構建 使用MOE 2 018.01 版中抗體構建模塊 (Antibody Modeler) 進行抗體可變區模型構建。從內置的抗體數據庫 (來源于www.rcsb.org)中搜索合適的FR 及CDR 模板，選用AMBER10:EHT 力場。使用GB/VI 溶劑化打分評價產生的過渡模型，對打分最高的模型進行最終的能量優化。

1.7.2 模型評價 通過MOE 中蛋白幾何模塊(Protein Geometry) 評估抗體模型質量，分析Phi-Psi 二面角并繪制拉氏圖 (aka. Ramachandran Plot)，并使用PROCHECK (http://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/) 的Verify3D 模塊來評估抗體模型中每個氨基酸殘基立體化學的構建質量。

1.7.3 分子對接 使用ChemBioDraw 2014 軟件繪制噻蟲嗪和噻蟲胺的二維結構，然后在MOE 中通過能量優化得到低能三維構象。用MOE 結構處理模塊 (Structure Preparation) 處理上一步構建好的抗體可變區模型，作為分子對接的受體。采用MOE 軟件中的對接模塊 (Dock) 對配體小分子和抗體的結合能力和姿勢進行預測。對接流程采用柔性對接模式，結合口袋氨基酸的側鏈可根據配體構象進行優化調整。

2 結果與分析

2.1 抗噻蟲嗪單克隆抗體特異性以及分子互作的動力學表征

采用SPR 進行小分子結合選擇性測試，結果如圖1 所示?？v坐標表示信號響應值，單位為共振單位（RU），與結合在芯片表面的物質的量相關，在進樣結束前5 s 的結合末期到進樣結束后10 s 的穩定初期，系統自主多次讀數，最后直接輸出SD 值。橫坐標是與偶聯有抗體的芯片進行小分子結合選擇性測試的8 種新煙堿類農藥和2 種有機磷類農藥 (50 nmol/L)，剛開始重復進樣2 針運行緩沖液HBS-EP+，RU值重復性較好，說明儀器開始時系統穩定。在新煙堿類農藥進樣前和進樣后均進樣兩針陰性樣品，且RU 值重復性較好，說明在進樣前后體系穩定且沒有假陽性，小分子選擇性高通量篩選結果可靠。噻蟲嗪的RU 值最大為39.5，噻蟲胺的RU 值為11.4，其他新煙堿類農藥 (呋蟲胺、吡蟲啉、氯噻啉、烯啶蟲胺、啶蟲脒和噻蟲啉) 的RU 值與陰性對照相近。表明單克隆抗體-E7E2 對噻蟲嗪具有高選擇性以及較強的結合活性，對噻蟲胺亦有中等結合反應，對其他新煙堿類殺蟲劑則沒有交叉識別作用。

將篩選出有結合活性的噻蟲嗪和噻蟲胺進行多循環動力學測試，結果如圖2 所示?？v坐標為信號響應值，與結合在芯片表面的物質的量相關；橫坐標為時間，包括0～120 s 的結合反應和之后600 s 的自然解離反應兩個時間段。圖中的彩色曲線從下到上依次為樣品低濃度到高濃度產生的傳感曲線。具有濃度依賴的傳感曲線經fit local 模型進行簡單的1 : 1 kinetics/affinity 擬合分析后產生黑色的擬合曲線。彩色的實驗曲線與黑色的理論擬合曲線基本匹配良好。由抗體與噻蟲嗪的結合解離動力學曲線測得結合速率Ka值為3.65 × 106(mol/L·s)-1，Kd值為2.92 × 10-4s-1，屬于“快結合-難解離”的動力學模式，在圖形上顯示為“快上-保持穩定”的特點。即表明抗體與噻蟲嗪有較好的結合活性，且抗體-噻蟲嗪復合物基本不發生解離反應。KD值為10-11mol/L，說明抗體對噻蟲嗪的親和力極高。由抗體與噻蟲胺的結合解離動力學曲線測得Ka值為1.25 × 106(mol/L·s)-1，Kd值為0.74 ×10-2s-1，屬于“快結合-快解離”的動力學模式。在圖形上顯示為“快上-快下”的特點。即在600 s 的解離反應后抗體-噻蟲胺復合物基本完全解離。KD值為10-9mol/L，與噻蟲嗪相比親和力降低了近100 倍。

2.2 單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區基因以及氨基酸序列鑒定

PCR 擴增產物經Sanger 測序后由IMGT 進行分析，序列均為完整的V-(D)-J 可變區序列，且序列中沒有早期終止密碼子，是可以被翻譯的功能序列。蛋白序列比對結果顯示，其與鼠源IgG 的一致性最高，說明測序基本正確。劃分3 個CDR 區的重鏈和輕鏈可變區基因及氨基酸序列如圖3 所示。

2.3 哺乳動物細胞HEK293(F) 表達全長重組抗體

以含有正確可變區序列的克隆載體為模板設計特異性引物，擴增得到含有表達載體同源臂的重/輕鏈可變區序列 (圖4A)，PCR 產物條帶清晰大小接近400 bp，與理論大小一致。經過純化的PCR 產物與雙酶切線性質粒pcDNA3.4-MOUSEIgG1-CH 和pcDNA3.4-MOUSE-Cκ 進行同源重組構建重組表達質粒。陽性重組質粒瞬時轉染HEK 293(F) 細胞表達全長重組抗體，純化后的抗體經12% SDS-PAGE 鑒定，50 kDa 的重鏈可變區條帶和25 kDa 的輕鏈可變區條帶清晰可見 (圖4B)。

2.4 全長重組抗體的識別活性

ic-ELISA 分析結果(圖5)表明，mAb-E7E2對噻蟲嗪的檢測靈敏度 (IC50) 為0.48 μg/L，識別線性范圍是0.13～1.80 μg/L，對噻蟲嗪以外的氯代煙堿類似物無顯著交叉反應 (表2)，這與上述SPR 的檢測結果一致，說明mAb-E7E2 是一株具有高特異性、高親和力的抗體。經過ic-ELISA 建立全長重組抗體對噻蟲嗪識別的標準曲線 (圖5)，檢測靈敏度 (IC50) 為0.41 μg/L，線性范圍是0.10～1.66 μg/L，對噻蟲嗪以外的氯代煙堿類似物無交叉反應 (表2)。因此，全長重組抗體表現出與親本單克隆抗體的識別性能一致，即具有對噻蟲嗪的高特異性識別活性和高親和力結合活性。

表2 噻蟲嗪全長重組抗體與親本抗體交叉反應率的比較Table2 Cross-reactivity (CR) of thiamethoxam and analogues determined by ic-ELISA based on full-length rAb and mAb-E7E2

2.5 噻蟲嗪抗體特異性識別的關鍵氨基酸殘基和主要作用力

2.5.1 抗噻蟲嗪抗體可變區高質量模型 抗體輕鏈和重鏈FR 區的模板分別為5MYX.A 和5MYX.B，輕鏈CDR 區模板為L1-1YED.L、L2-6BPD.B 和L3-1YED.L，重鏈CDR 區模板為H1-3BSZ.N、H2-3BSZ.N 和H3-2OP4.H?？贵wVL 序列和模板序列FR 區的一致性為93%，抗體VH 序列和模板序列FR 區的一致性為84.2%，抗體6 個CDR 區-L1/L2/L3/H1/H2/H3 的序列與模板序列之間的一致性分別為93.8%、100%、77.8%、80%、64.7%和53.8%。其中重鏈CDR3 因為其高變性與模版序列的一致性較低，為53.8%，這已是現有數據庫中最高同源度的模板結構，通常一致性大于30%就可以用于同源模建。經過同源建模程序產生mAb-E7E2可變區模型 (圖6A)。為了評價所構建模型的質量，繪制模型結構的Ramachandran 圖 (圖6B)，大部分氨基酸都落在綠色的允許區域，少數氨基酸落在黃色的最大允許區域，沒有落在空白不允許區域的氨基酸。在Verify3D 圖中 (圖6C)，86.38%(至少80%) 氨基酸殘基的3D-1D 平均分數 ≥0.2。這兩種評價結果均表明所構建的抗體可變區空間模型質量好，可信度高。

2.5.2 抗體特異性識別噻蟲嗪的分子機制解析 分子對接用于預測小分子與抗體的結合方式以及參與形成主要作用力的關鍵氨基酸殘基?？贵w6 個CDR 區形成的空腔被定義為結合口袋。經過分子對接程序，結合打分、目視檢查和經驗分析挑選出小分子與抗體的最佳對接姿勢，抗體與噻蟲嗪和噻蟲胺的對接二維平面圖和三維空間立體圖如圖7 所示，參與形成復合物的關鍵氨基酸和主要作用力列于表3 中。計算出的抗體與噻蟲嗪的結合自由能為 -22.91 kJ/mol 顯著低于抗體與噻蟲胺的結合自由能，表明抗體與噻蟲嗪的對接結合親和力較高可形成更穩定的復合物，這與SPR測得的親和力和ELISA 測得的靈敏度結果一致，SPR 測得抗體對噻蟲嗪的KD= 7.995 × 10-11mol/L，是噻蟲胺的 (KD= 5.94 × 10-9mol/L) 74 倍，即對噻蟲嗪的識別活性更好；ELISA 測得抗體對噻蟲嗪的識別靈敏度IC50值為0.48 μg/L，與噻蟲胺的交叉反應較弱，僅為0.04%。分子對接預測結果表明，氫鍵和CH-Pi 鍵是抗體與噻蟲嗪形成穩定復合物最主要的非共價分子間作用力。噻蟲嗪“-NO2”中的氧原子作為氫鍵受體與Asn39(L-CDR1)“-NH2”中的氮原子形成氫鍵 (0.338 nm)。噻蟲嗪六元環中鄰近氧原子的CH 基團與His35(H-CDR1) 側鏈咪唑基的π 電子共軛體系形成CH-Pi 鍵 (0.345 nm)。噻唑環的π 電子共軛體系與Trp108(H-CDR3) 側鏈苯環形成CH-Pi 鍵 (0.457 nm)。噻蟲嗪與結合口袋中另外8 個氨基酸殘基形成的范德華力同樣有助于形成穩定的抗體-噻蟲嗪復合物。

表3 抗噻蟲嗪抗體與噻蟲嗪和噻蟲胺的分子對接計算結果Table3 Computer aided molecular docking results of anti-thiamethoxam antibody with thiamethoxam and clothianidin

3 小結與討論

表4 本研究抗噻蟲嗪抗體與已報道抗體性能比較Table4 Comparison of the sensitivity of anti-thiamethoxam Ab with other reported Abs

可分泌高靈敏特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株是獲得重組抗體可變區序列的重要來源，與非免疫來源的文庫篩選法相比，可更高效、精準地獲得特異性較高的抗體可變區序列。本研究抗體與已報道的用于噻蟲嗪免疫檢測的抗體相比(表4)，靈敏度 (IC50) 與大部分報道的單克隆抗體一致 (0.2～1 μg/L)，顯著高于Kimet 等[7]于2003年報道的基于多克隆抗體建立的dc-ELISA 方法。本研究的抗體與其他新煙堿類結構類似物的交叉反應率 ＜ 0.04%，屬于交叉反應的最低水平。

由哺乳動物細胞HEK 293(F) 表達的全長重組抗體，經ELISA 評價表現出與親本單克隆抗體特異性和親和力的一致性。最近的研究指出，與大腸桿菌和畢赤酵母相比，哺乳動物細胞系分泌的Fab 與親本Fab 性能最為接近[24]；哺乳動物細胞系表達的全長IgG 與抗原的相對結合親和力比親本Fab 高約10 倍[25]。

為進一步研究抗體-噻蟲嗪的相互作用，通過分子模擬和對接分析，認為該抗體可以識別噻蟲嗪和噻蟲胺兩個化合物的主要原因為：兩個化合物本身的結構相近，都含有氯代噻唑環、類胍基結構和硝基，并且兩個化合物與抗體對接的空間姿勢相近，即氯代噻唑環朝向重鏈可變區，類胍基結構和硝基朝向輕鏈可變區?？贵w與兩個化合物結合參與形成疏水結合口袋的氨基酸基本相同，包括Tyr37(L-CDR1)、Val94(L-CDR3)、Gln95(L-CDR3)、Gly96(L-CDR3)、His101(LCDR3)、Trp33(H-CDR1)和Gly99(H-CDR3)，只有Leu55(L-CDR2) 為識別噻蟲胺獨有的氨基酸。噻蟲嗪和噻蟲胺均與Asn39(L-CDR1) 側鏈形成氫鍵，氫鍵距離分別為0.338 nm 和0.305 nm。綜上可以認為，位于重鏈CDR 區的2 個氨基酸殘基和位于輕鏈CDR 區的6 個氨基酸殘基與抗體對噻蟲嗪的選擇性 (特異性) 相關。

但是，SPR 和ELISA 結果表明，抗體對噻蟲嗪和噻蟲胺的結合親和力具有極顯著差異，即SPR測得抗體對噻蟲嗪的解離平衡常數KD= 7.995 ×10-11mol/L，是噻蟲胺KD= 5.94 × 10-9mol/L 的74 倍；ELISA 測得抗體對噻蟲嗪的識別靈敏度IC50值為0.48 μg/L，與噻蟲胺的交叉反應率僅為0.04%。分析其原因為：噻蟲嗪因其具有兩個環形剛性骨架減少了空間位阻，能與口袋很好地契合，而噻蟲胺則具有更多的柔性骨架，空間位阻較大。與噻蟲胺相比，噻蟲嗪六元環中多兩個碳原子，也可能增加疏水性，與結合口袋中的疏水區很好的契合，有助于穩定結合、增加親合力。噻蟲嗪主要通過氫鍵、CH-Pi(C-H…π) 鍵和范德華力與抗體形成復合物，噻蟲嗪除可形成上述提到的1 個氫鍵作用外，其六元環鄰近氧原子的CH基團還可與His35(H-CDR1) 側鏈的咪唑環形成CH-Pi 鍵 (0.345 nm)，噻唑環的π 電子共軛體系與Trp108(H-CDR3) 側鏈形成CH-Pi 鍵 (0.457 nm)。噻蟲胺主要通過氫鍵和范德華力與抗體形成復合物，除了上述提到可形成的1 個氫鍵外，再無其他主要的分子間作用力，因此，抗體對噻蟲嗪表現出極高的結合親和力，而對噻蟲胺的交叉反應很低，可以推測位于重鏈CDR 區的兩個氨基酸His35(H-CDR1) 和Trp108(H-CDR3) 殘基對抗體與噻蟲嗪的結合親和力高低有顯著影響。本研究表明，不僅位于抗體重鏈CDR3 區的氨基酸對抗體的選擇性識別和結合活性有影響，還發現位于輕鏈CDR1 和CDR3 區的氨基酸同樣是構成疏水口袋和形成主要作用力的關鍵氨基酸，這與Murphy等[26]使用計算機輔助分析重組抗體與毒素結合特性的結論一致，即位于輕鏈CDR3 區的氨基酸對于結合活性同樣具有重要性。

綜上所述，本研究通過基因工程技術和哺乳動物細胞體外表達技術獲得了與親本單克隆抗體性能相當的抗噻蟲嗪全長重組抗體，采用同源建模和分子對接技術研究了可變區三維結構并解析了抗體-農藥相互作用機理，探明了關鍵氨基酸位點、主要作用力及相關影響因素，這將有助于進一步改造獲得高質量的抗體，并為今后抗體庫的構建提供理論依據。