石家莊地區新生兒原發性肉堿缺乏癥串聯質譜篩查結果分析

賈立云，封紀珍，王 熙，馬翠霞，封露露

(河北省石家莊市婦幼保健院新生兒疾病篩查診治中心，河北 石家莊 050051)

原發性肉堿缺乏癥(primary carnitine deficiency,PCD)又稱肉堿轉運障礙或肉堿攝取障礙，是由于細胞膜肉堿轉運蛋白的編碼基因SLC22A5突變致脂肪酸β氧化障礙而引發的疾病，是脂肪酸氧化代謝障礙中最常見的疾病類型，遺傳方式為常染色體隱性遺傳[1]。肉堿缺乏可導致中、長鏈脂肪酸不能從細胞質轉運至線粒體內進行β氧化，進而引起一系列生化代謝異常，最終導致肝臟、心肌、骨骼肌等多系統損害[2]。PCD可于任何年齡發病，是潛在的致死性疾病。臨床表現個體差異較大，主要表現為低酮型低血糖、肌無力、肝腫大以及擴張型心肌病，部分患者可終生無異常表現，發病的患者未經治療具潛在致死性[3]，左旋肉堿替代治療的介入，使越來越多PCD患者的預后得到了改善。同時，PCD發病機制和基因突變的研究也在不斷地深入。PCD患兒臨床表現具有異質性及非特異性特點，易誤診或漏診，隨著串聯質譜技術的應用，新生兒檢出率顯著提高[4-5]。本研究采用串聯質譜技術對新生兒進行多種遺傳代謝病篩查，統計出石家莊地區PCD患病率為1/17 785，進一步采用二代測序技術對部分患兒進行SLC22A5基因檢測，發現了4種突變位點。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 收集2014年1月—2019年12月在石家莊市15個縣區所轄的26個助產機構、7個市區所轄的12個助產機構分娩的160 061例活產新生兒(3～20 d)。

本研究經醫院醫學倫理委員會批準通過(No.202019)，篩查前家長均簽署知情同意書。

1.2串聯質譜篩查及基因突變檢測

1.2.1儀器與試劑 Waters TQD串聯質譜儀、Waters 2777C自動進樣器、Waters 1 525 μ高效液相色譜儀泵及MassLynxV4.1串聯質譜篩查信息處理系統均購自美國Waters公司；微孔板恒溫孵育震蕩儀購自中國杭州奧盛儀器有限公司；超聲波清洗機購自中國康士潔有限公司；通風柜購自中國杰瑞電氣有限公司；串聯質譜-非衍生化游離肉堿及酰基肉堿測定試劑盒購自中國山東英盛公司。

1.2.2標本采集 新生兒出生72 h，充分哺乳6～8次后，于足跟兩側采集3個直徑>8 mm、圓形均勻血斑，懸空自然晾干2～3 h，置于密封袋封口，最遲不超過5個工作日由各助產單位上報至婦幼機構并冷鏈遞送至石家莊市新生兒疾病篩查中心，置于2～8 ℃冰箱密封保存待檢。

1.2.3檢測方法 采用串聯質譜干血濾紙片—非衍生法：用打孔器取直徑3 mm高、低質控樣本和待測樣本血斑，置于U型底96孔微孔板中；每孔加入90 μL萃取工作液，30 ℃，700 r/min，震蕩孵育45 min；轉移75 μL上清液至V型底96孔板的對應位置，覆上鋁箔紙以減少揮發；將V型板放入自動進樣器中，建立樣品列表，采用多反應監測模式進行檢測，采用MassLynxV4.1串聯質譜篩查信息處理系統，通過比較分析物和內標分析物的信號積分面積來進行計算待檢物濃度水平。

1.2.4質量控制 檢測過程中將質控及樣品共同測定，質控品的處理方法及上機檢測條件與樣本一致，高、低質控品的檢測值在靶值±2SD范圍內，實現對檢測過程的質量控制，以及每年參加國家衛健委臨床檢驗中心的室間質量評價并取得合格證書。

1.2.5診斷方法 ①血游離肉堿水平持續低于7 μmol/L，需鑒別是否為母源性肉堿缺乏；②肉堿轉運蛋白的編碼基因SLC22A5檢測到突變。

1.3治療與隨訪 對確診病例采用左卡尼汀替代治療，具體劑量依據肉堿水平進行調整。急性期靜脈給藥，劑量為200～400 mg·kg-1·d-1，并同時對癥支持治療；穩定期口服給藥，劑量為100～200 mg·kg-1·d-1，分3次給藥。此外，避免饑餓及長時間高強度運動，防止低血糖發生。治療初期隔2～3周隨訪1次，血游離肉堿正常且穩定后隔1～3個月隨訪1次，治療期間定期進行相關檢查，及時調整治療方案，并評估生長、智力及運動發育情況。

2 結 果

2.1PCD患兒總體篩查情況 160 061例新生兒中，篩查陽性患兒21例，召回20例，確診17例，其中PCD 9例，患病率為1/17 785；母源性肉堿缺乏患兒8例。

2.29例PCD患兒及母親串聯質譜結果 9例PCD患兒串聯質譜篩查結果進行統計分析，初篩結果中游離肉堿及多種酰基肉堿水平降低，游離肉堿為4.47(1.77～6.78) μmol/L；復查結果為4.83(2.80～7.32) μmol/L；患兒母親肉堿水平檢測結果顯示游離肉堿及酰基肉堿水平基本居于正常水平，游離肉堿水平為12.97(11.16～15.36) μmol/L，排除母源性，見表1。

表1 9例PCD患兒及母親游離肉堿及酰基肉堿檢測水平Table 1 Detection levels of free carnitine and acylcarnitine in 9 neonates with PCD and their mothers [n=9，M(最低值～最高值)，μmol/L]

2.38例母源性肉堿缺乏癥患兒及母親串聯質譜結果 8例母源性肉堿缺乏癥患兒串聯質譜篩查結果進行統計，初篩結果游離肉堿及多種酰基肉堿水平降低，其中游離肉堿初篩結果為4.52(2.70～7.93) μmol/L；復查結果為6.09(4.14～10.04)μmol/L，較初篩水平有所升高；患兒母親游離肉堿及酰基肉堿水平均低于正常水平，游離肉堿水平為3.46(1.50～7.86) μmol/L，見表2。

表2 8例母源性肉堿缺乏癥患兒及母親游離肉堿及酰基肉堿檢測水平Table 2 Detection levels of free carnitine and acylcarnitine in 8 cases of neonates with maternal carnitine deficiency and their mothers [n=8，M(最低值～最高值)，μmol/L]

2.44例PCD患兒基因突變分析 9例PCD患兒中，4例進行了SLC22A5基因檢測，其中復合雜合1例、純合1例、雜合2例，見表3。2例雜合患兒血游離肉堿和酰基肉堿水平持續下降，排除母源性。基因突變分析發現4種突變位點，分別為c.865C>T、c.1400C>G、c.428C>T和c.1462C>T，見圖1。

表3 4例PCD患兒基因突變分析結果Table 3 Results of gene mutation analysis in 4 neonates with PCD

2.5治療與隨訪結果 9例PCD患兒中6例持續接受治療，左卡尼汀劑量為100～200 mg·kg-1·d-1，發育正常；3例患兒治療一段時間后停藥，發育正常。患兒治療后肉堿水平見表4；治療及發育情況見表5。

表4 9例PCD患兒治療后游離肉堿及酰基肉堿水平Table 4 Levels of free carnitine and acylcarnitine in 9 neonates with PCD after treatment [n=9,M(最低值～最高值),μmol/L]

3 討 論

3.1PCD篩查與診斷 串聯質譜技術的應用，使得越來越多的PCD患兒可以在新生兒早期被發現，PCD的診斷主要依賴于血游離肉堿及酰基肉堿的水平以及SLC22A5基因突變分析。本研究檢出的9例PCD患兒初篩血游離肉堿均低于實驗室截斷值(<7 μmol/L)，均值只有4.47 μmol/L；9例PCD患兒母親血游離肉堿均值為12.97 μmol/L，而8例母源性肉堿缺乏癥患兒母親血游離肉堿均值僅為3.46 μmol/L。因此，對患兒及其母親進行血游離肉堿水平檢測，可發現母親PCD。隨著二代測序技術的不斷推廣應用，基因檢測可明確PCD患兒病因；本研究檢出的9例PCD患兒中，只有4例患兒進行了基因檢測。

3.2PCD患病率 PCD患病率具有明顯種族差異，據文獻報道，該病在法羅群島患病率最高，為1/300[6]，美國患病率為1/20 000～1/70 000[7]，日本患病率為1/40 000[8]，澳大利亞的患病率為1/120 000[9]，中國報道的新生兒篩查PCD患病率為1/20 000～45 000[10-11]，人群中雜合子的攜帶率為0.5%～0.1%[12-13]。本研究共篩查新生兒160 061例，確診PCD 9例，患病率為1/17 785，高于我國報道的新生兒篩查PCD患病率，考慮可能與地域差異和統計年限有關。

3.3基因突變分析 PCD的致病基因為SLC22A5，該基因定位于染色體5q31.1，長約30 kb，包含10個外顯子和3個內含子，其編碼的肉堿轉運蛋白由557個氨基酸組成[14]。目前已經發現180余種突變類型，多為錯義突變，無義突變和移碼突變次之[2]；國內大多數研究認為c.760C>T(p.R254X)和c.1400C>G(p.S467C)是我國大陸地區的熱點突變[15]。本研究4例患兒中復合雜合1例、純合1例、雜合2例，其中c.1400C>G(p.S467C)的突變頻率較高，為33.3%，與溫鵬強等[14]報道的結果相符，未發現c.760C>T(p.R254X)，考慮可能與病例少有關。

3.4治療及隨訪 PCD可于任何年齡發病，主要表現為擴張性心肌病、肝腫大、肌無力等，若未能及時發現和治療，可導致死亡，因此，早期篩查、診斷及治療是改善預后的關鍵。PCD的治療原則是避免感染、長期饑餓及高強度運動，需用左卡尼汀進行替代治療，維持血漿游離肉堿水平>15～20 μmol/L。出現能量代謝危象時，立即靜脈輸注葡萄糖，以維持血糖>5 mmol/L，并靜脈或口服左卡尼汀200～400 mg·kg-1·d-1；病情緩解期需根據血游離肉堿水平進行個體化治療，建議口服左卡尼汀100～300 mg·kg-1·d-1；穩定期可根據血游離肉堿水平，口服左卡尼汀100～200 mg·kg-1·d-1[3]。本研究檢出的9例PCD患兒確診后立即給予左卡尼汀替代治療，其中3例患兒治療一段時間后停藥，其余6例患兒均持續接受藥物治療，隨訪結果未出現臨床癥狀，發育正常。

采用串聯質譜技術進行新生兒疾病篩查，可及早檢出患兒及母親PCD，并給予早期干預和治療，使患兒生長、智力及運動發育正常；二代測序技術可進行相關基因突變檢測；二者聯合應用可明確病因，對家系提供遺傳病咨詢依據。