骨髓細胞在牽拉成骨中作用的研究進展

方 均，張 一(綜述)，王 斌*(審校)

(1.河北省唐山市第二醫院手外科，河北 唐山 063000;2.華北理工大學附屬醫院骨科，河北 唐山 063000)

牽拉成骨(distraction osteogenesis，DO)是在截骨的兩端安裝牽拉裝置，然后以適當的速率牽拉截骨端，激發體內組織再生能力，在延長區內誘導新骨形成的過程，目前已廣泛應用于骨缺損、骨延長、骨感染、肢體矯形、下肢慢性缺血性疾病[1]等。成骨的作用離不開骨髓與骨膜的共同作用。骨髓中含有多種細胞成分，這些細胞是DO過程中形成新血管及骨組織的重要來源之一。從骨髓中分離的成人間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，MSCs)具有多種潛能，可分化為骨、軟骨、肌肉和脂肪等組織。骨髓中同時含有豐富的生長因子，這些生長因子為在DO中新骨形成中起到重要的調節作用。在DO中，血管再生是新骨生成的基本保證，而骨髓中富饒的血管系統，為DO提供了充足的營養與支持作用。既往有學者以骨膜為入手點綜述其在DO中的作用機制[2]，故本文以骨髓細胞為入手點綜述其對DO的作用機制。

1 DO相關的骨髓細胞成分及其發生

骨髓位于髓腔及松質骨間隙中，是一種近似海綿狀、膠凍狀或脂肪性的柔軟組織，由血管、網狀組織和各種基質組成，富含多種細胞成分。骨髓促進牽張成骨的作用與其細胞成分密切相關，主要包括骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)[3]、內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)[4]、成骨細胞(osteoblasts，OBs)[5]、破骨細胞(osteoclasts，OCs)[5]等。

BMSCs是一種來源于中胚層的非造血性多能干細胞，存在于髓腔骨內膜、基質以及血管周圍，具有極強的成骨能力。Pittenger等[6]對BMSCs的誘導分化實驗中證明，在BMSCs的培養基中加入不同的誘導劑可誘導形成脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞等。來源于髓系血細胞的單核巨噬細胞所融合而成的破骨細胞，則具有吸收骨質的能力。成骨細胞的生成骨質能力與破骨細胞的骨質吸收能力共同作用，參與骨質的改建與塑形。因此，骨髓間充質干細胞、成骨細胞、破骨細胞等在DO中起到重要的成骨塑形作用。

EPCs起源于胚胎發育早起的中胚層，主要來源于骨髓，是一種能直接分化為血管內皮細胞(endothelial cells，ECs)的前體細胞，可促進血管的修復與再生[7]。Lee等[8]在DO過程中檢測到EPCs分泌的細胞動員因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、超化因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)增加，證明了DO過程中EPCs的動員。SDF-1可促進DO中延長區新骨礦化。Lee等[9]的另一DO實驗，在大鼠DO模型中測量血流量及EPCs分布，證明了EPCs的動員以及歸巢有助于DO中新血管的生成。Jia等[4]與Lee等[9]分別在大鼠實驗與臨床研究中證明了骨髓細胞中的內皮祖細胞通過刺激血管形成加快了DO的骨礦化過程。由此看來，EPCs分化為ECs促進血管形成，對于DO中髓腔的循環起到了至關重要的作用，眾所周知循環系統可發揮營養支持作用；同時EPCs分泌的SDF-1促進了DO的骨礦化。因此EPCs也是DO中不可或缺的細胞之一。

2 DO中重要骨髓細胞間相互作用

復雜的生物學效應并不是由某種細胞單獨發揮作用，而是多種細胞之間通過相互作用來表達。

BMSCs和EPCs作為DO中兩種重要的細胞，各司其職的同時又互相影響。有研究表明，當BMSCs與EPCs共同培養相比單獨培養時，VEGF、Ⅰ型膠原蛋白(type-Ⅰ collagen)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨結核素(osteonectin，OCN)的mRNA表達明顯上調，說明BMSCs與EPCs相互作用既可以促進成骨也可以促進成血管[10]。EPCs已被證實可以通過分泌某些因子分化為血管內皮細胞，Qin等[11]對EPCs與BMSCs研究指出，EPCs通過分泌細胞外小泡(endothelial progenitor cells extracellularvesicles，EPC-EVs)來調節BMSCs的增殖與分化。Yu等[12]的研究中表明，當BMSCs與EPCs共同培養時，不僅相互促進增殖，而且提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達以及降低了促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表達，因此兩種細胞共同培養時具有互相抑制凋亡的作用，同時也證明了BMSCs與EPCs兩者通過PI3K/Akt/Cox2軸來介導上述作用。因此，DO中的BMSCs與EPCs共存時相互提高活性，不僅促進各自獨有的作用，而且共同促進成骨塑形與成血管作用。

骨的動態平衡由OCs與OBs共同作用，前者移除舊的骨質，后者形成新的骨質。當這種動態平衡被打破時，會導致骨質疏松癥或骨硬化癥。成骨細胞可分泌多種細胞因子，如核因子κ B受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor，M-CSF)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)等[13]。M-CSF上調破骨細胞前體細胞膜上RANK的表達，加強RANK的配體RANKL與其結合，促進破骨細胞的分化以及骨質的吸收[14]。MCP-1與破骨細胞前體細胞表達的MCP-1受體特異性結合，RANKL調控前體破骨細胞向破骨細胞分化的過程[15]。破骨細胞也可分泌多種細胞因子影響成骨細胞的發生與其成骨作用，如肝配蛋白、臂板蛋白和叢狀蛋白等[16]。總的來說，DO中新骨的改建與塑形離不開OBs與OCs的相互作用。

各種骨髓細胞在DO過程中發揮不同的作用，相互影響共同調控DO過程，簡要作用見表1。

表1 骨髓細胞在牽拉成骨中的作用

3 DO中骨髓重要細胞的信號通路

3.1經典BMP信號通路 骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的一類多功能生長因子，目前對其研究及應用最為廣泛，BMP的信號傳導既有典型的依賴Samd途徑[17]，也有非典型的不依賴Samd途徑(如p38絲裂原活化蛋白激酶，p38-MAPK)[18]。

BMP在DO中具有極強的成骨作用[19-20]。DO中，經典的級聯反應BMP-Samd信號通路，BMP2、BMP4等首先與細胞膜上具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的受體BMPR Ⅱ結合并使其磷酸化，然后激活受體BMPR Ⅰ，BMPR Ⅰ進一步磷酸化Smad1、Smad5和Smad8，磷酸化后的Smad1、5、8與Smad4在細胞質中形成復合物，轉位到細胞核后，復合物與成骨細胞中的其他轉錄因子如Runx2相互作用使靶基因翻譯及表達相關蛋白[18]，促進BMSCs向前體成骨細胞分化[21]。Khanal 等[22]用免疫組織化學方法的對DO中的BMP2、BMP4和Smad1、Smad5、Smad8進行檢測，這些因子首先出現在截骨邊緣的間充質細胞與成骨細胞中，隨著延長的進行這些細胞高度表達，牽拉結束后相關因子隨著時間的推移逐漸表達降低。Li等[23]在兔DO的模型中指出，應用rhBMP-2和rhBMP-2聯合纖維蛋白的實驗組無論在放射學、Micro-CT、組織學還是彎曲力學檢查上，均優于空白組及對照組，說明了rhBMP-2對DO具有較強的成骨作用。

3.2p38/MMP-2信號通路 DO穩定、持續、緩慢的牽拉提供了一個幾乎靜態的機械應變力，BMSCs感知靜態應變力后，被血管基底膜(vessel of basilar membrane，VBM)釋放并遷移到延長區促進骨的再生與修復。p38蛋白作為絲裂原活化蛋白激酶超家族的成員之一，可調節細胞對機械信號的反應及促進細胞遷移。Yang等[24]團隊的一項實驗中證實了實驗組(DO組)大鼠的延長區骨痂中Nestin+/p38+細胞數明顯高于對照組(非DO組)，且體外實驗中具有活性的p38可促進BMSCs的遷移及應用p38的阻斷劑后阻斷了p38的活化及MMP-2的表達，首次揭示了靜態應變通過p38/MMP-2信號通路促進BMSCs遷移。

3.3FGF/FGFR信號通路 成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)在胞膜上與具有酪氨酸激酶活性的受體FGFR(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)特異性結合后，引起細胞內信號傳導級聯反應，其中對DO中成骨細胞具有重要影響。Haque等[25]采用兔脛骨的DO模型分析了FGF1，FGF2，FGF18，IGF1，IGF2，TGFβ1的時間與空間上的分布，結果顯示延長期的成骨細胞明顯表達FGF2，且FGF18不同于其他影響因子，其在牽拉各個時期均顯著表達，提示FGF18對DO的作用尤為顯著。Fang等[26]對小鼠下頜骨DO的研究中表明，在截骨后第13天(延長期)，正常牽拉組小鼠的FGF2水平是急性延長組小鼠FGF2水平的4倍，正常牽拉組小鼠均獲得骨性愈合，而急性延長組小鼠則出現纖維性骨不連的情況，表明FGF2對DO具有重要的成骨作用。

3.4SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路 細胞基質衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)與G蛋白偶聯受體C-X-C基序趨化因子受體(C-X-C motif receptor 4，CXCR4)特異性結合后，PI3K(磷脂酰肌醇3激酶)再被偶聯受體上的Gβγ亞基結合，使PIP2磷酸化成PIP3，PIP3作為細胞內重要的第二信使可磷酸化Akt(蛋白激酶B)從而發揮下游的生物學效應。SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路作為人體中一條重要的信號通路，有研究表明其不僅對EPCs募集、分化、遷移、抗凋亡具有關鍵的作用[27-28]，也有研究表明其同時對BMSCs具有分化、遷移作用[29-30]。

Fujio等[31]對小鼠DO的實驗中證明快速DO組(H-DO)的小鼠局部應用SDF-1后，可募集骨髓的內皮細胞與EPCs加速血管生成從而促進延長區的礦化。Xu等[32]在大鼠DO與骨折的模型中證明，DO組SDF-1和成骨相關基因的表達水平均高于骨折組，SDF-1的峰值出現在牽張期結束時，且在大鼠BMSCs的培養中，應用CXCR4拮抗劑AMD3100后，堿性磷酸酶與早期成骨相關基因表達明顯降低。

3.5Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin信號通路又被稱為經典的Wnt通路，Wnt與細胞表面受體Frizzled結合后阻止β-catenin降解，上調的β-catenin轉移到細胞核后刺激下游相關基因的表達。Wnt/β-catenin信號已被證明可以促進BMSCs向成骨細胞的分化[33]。Wang等[34]對大鼠DO實驗中證明，應用Wnt通路拮抗劑rrDkk1后，β-catenin和Lef-1受到抑制，長期的結果顯示延長區礦化明顯受限，因此Wnt信號通路參與了DO的整個過程。

DO延長區中新血管形成、新骨形成改建塑形受到可受到多條關鍵信號通路共同調控，經典BMP信號通路、p38/MMP-2信號通路、FGF/FGFR信號通路、SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等在調節新骨形成改建塑形扮演了重要角色，同時SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路對延長區中新血管的形成也起到了不可或缺的作用。p38/MMP-2信號通路、SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路受到牽張力的刺激后可促進BMSCs向延長區的遷移，當BMSCs到達延長區后又受到經典BMP信號通路、FGF/FGFR信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等的調控，促進BMSCs向OBs的分化；SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路與此同時調控EPCs的募集、分化，加速延長區中新血管的形成，為成骨過程提供有利的環境。這些信號通路相互聯系、互相影響、共同作用。雖然DO中信號通路的研究在某些方面取得了重要進展，但各個通路之間是否存在多個交集、是否單個信號可調控多通路的機制仍未完全明確，有待學者們的進一步研究。

4 DO中髓腔內的循環

DO依賴于良好循環的建立，因髓腔中無淋巴循環，故主要是延長區新血管的形成，局部血供是新骨形成最基本的條件，各種細胞成分、營養因子多通過血管系統到達所需部位，促進DO中骨的形成、塑形與改建。

正常的骨組織中，滋養血管穿過皮質骨進入髓腔，滋養動脈形成的小分支動脈圍繞在滋養靜脈形成的中央靜脈的周圍，部分進入皮質骨哈弗管的細小動脈經血竇回流到小靜脈，髓腔內的血液流動呈環形，髓腔中心流向髓腔周圍再返回髓腔中心[35]。在DO中，髓腔內血管的再生，為延長區提供了多種循環因子以及細胞，同時遷移的血管內皮細胞是新骨生成與骨改建重塑中的活躍分子。Choi等[36]對大鼠脛骨進行了DO研究，在延長區采用血管鑄型與掃描電鏡觀察的方法，結果顯示截骨后髓內小靜脈與血竇明顯擴張，并且在血竇周圍出現了許多新生萌芽血管，延長區內新骨的形成從血竇生成開始，伴隨著延長，從截骨面新生的血管相向而行，血管生成與血流量逐漸豐富，但并未進入由成纖維細胞、軟骨樣細胞與中間態細胞形成的位于延長區中間的纖維間帶(fibrous interzone，FIZ)中，延長期結束后，截骨面兩側相向而行的新生血管互相吻合，此后發生骨組織的再生。只有形象的觀察正常骨組織與DO中的血液循環，才有助于學者們深入了解DO中新骨形成、塑形與改建這一復雜的新骨形成規律。

5 骨髓細胞促進DO愈合的臨床應用

利用骨髓細胞移植的方式加速DO愈合的報道越來越多，并取得了令人滿意的結果。Kitoh等[37]對46例(92側骨)患者的下肢進行DO技術后采用注射自體骨髓系細胞(bone marrow cells，BMC)聯合富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)治療的臨床研究中表明，注射BMC+PRP治療組患者的愈合指數明顯小于未注射的對照組，治療組未出現延遲礦化，對照組有45%的患者出現延遲礦化，兩組有關并發癥發生率分別為6%和23%，各數據差異均有統計學意義。同時發現注射BMC+PRP后股骨的治療效果優于脛骨。Memeo等[38]對8例因軟骨發育不全而行DO延長術治療但發生延遲愈合的患者采用了注射自體濃縮骨髓抽吸物(bone marrow aspirate concentrate， BMAC)，經髂骨骨髓抽取的BMAC富含干細胞、單核細胞、淋巴細胞及骨髓固有細胞等有核細胞，將BMAC注射到延長區的新生骨中。術后所有8例患者的新生骨的質量得到改善，延遲愈合平均恢復時間為5.2個月，愈合指數18.7～23.8 d/cm，平均23.1 d/cm。Memeo等[38]可能是首次使用BMAC治療因軟骨發育不全患者行DO中延遲愈合的問題。Lee等[39]對20例行DO延長雙側脛骨的患者進行隨機分組后，治療組中10例(20側脛骨)患者注射自體BMAC+PRP，而對照組未注射。術后治療組的每側皮質愈合指數及完全負重指數均小于對照組，差異有統計學意義，提示了治療組的骨愈合較快且較早達到完全負重，證明了在DO中截骨部位應用BMAC+PRP有助于促進骨愈合。Lim等[40]對1例下頜骨發育不良的患者采用了DO矯正畸形，為縮短治療周期，該團隊將取自患者髂骨的骨髓分離出BMSCs，經傳代培養后分化為OBs，注射到礦化期的延長區中。該患者獲得了有效愈合且沒有出現任何并發癥。

由于骨髓細胞富含單個核細胞，其成分較多，具有較強的分化能力，在骨愈合方面具有很高的潛力；富血小板血漿中同時富含一些營養因子。因此究竟是骨髓細胞或是富血小板血漿起主要作用，亦或是兩者對于加速DO愈合同等重要，尚未有明確報道。仍有待學者們的進一步探索。

6 總結與展望

本文以骨髓細胞在DO中作用機制為切入點，總結骨髓中與DO有關的細胞(如BMSCs、EPCs、OBs、OCs等)及其發生、細胞間的相互作用、細胞相關通路等，發現各司其能的同時又共同調控延長區新血管形成和新骨的形成改建塑形，通過簡述DO髓腔內的循環有助于加深了解DO這一復雜的新骨形成規律，列舉骨髓系細胞的臨床應用有力的佐證了骨髓細胞在DO中不可或缺的地位。

目前學者們多以骨膜為切入點研究DO的作用機制，但骨髓與骨膜同為骨骼系統的重要組成部分，共同調控DO這一過程。經查閱相關文獻后，骨髓細胞在DO中的作用機制相對較少。骨髓細胞間通過何種具體機制相互作用共同DO愈合仍未明確，未來的研究方向應著重于細胞間的相互作用，因為生物學效應依賴多細胞的共同的作用。在DO中，臨床醫師在詳細了解每種細胞的分子機制、細胞間相互作用及生物信號通路等更能造福患者并推動DO技術的發展。

DO技術通過對所牽拉組織施加緩慢、持續、穩定的牽張力，可使相應組織細胞發生類似于胚胎再發育的過程。經過半個多世紀的發展，此技術應用于多種難治性疾病并取得了顯著成效，伴隨著新研究方法的出現，可能發現更多的機制以及某些已發現的機制需要進一步的完善。