維生素在皮膚抗光老化方面的研究進展

莊 潔 陳晗俊 吳 旭

（華熙生物科技股份有限公司上海研發中心，上海，200131）

“抗衰老”是人們追求的永恒目標，也是科學研究者們的研究熱點。皮膚是人體最大的器官，其衰老最顯而易見，例如出現皺紋、干燥、松弛等現象。現有的研究發現，皮膚衰老包括兩個同時進行的獨立過程：（i）固有的老化，即按時間發展的自然老化，以及（ii）外在老化或光老化，這是由于其暴露于紫外線（UV）在內的環境因素導致的。自然老化的皮膚會變薄、干燥，并出現細皺紋[1]。而光老化導致的臨床上明顯的皮膚改變，以深皺紋、粗糙、松弛、斑點狀色素沉著、毛細血管擴張和各種良性和惡性腫瘤為特征[2]。

在生理上，光老化主要取決于陽光的照射程度和皮膚中黑色素的含量。皮膚暴露在陽光下的區域，例如臉部、頸部、上胸部、手和前臂，是這些變化最常發生的部位。太陽光是紫外線（200～400 nm）輻射的主要來源。其中包含UVC輻射（100～290 nm），它幾乎完全被臭氧層吸收，并且不影響皮膚； UVB（290～320 nm）會影響皮膚（表皮）的淺表層，并導致曬傷；UVA（320～400 nm）被認為對皮膚的影響是次要的，但研究表明它們在皮膚中的滲透更深，會造成更嚴重的損害[3]。

紫外線還直接或間接引發和激活人體皮膚中復雜的生物化學反應。此外，紫外線誘導的活性氧（ROS）會干擾信號通路。在分子水平上，紫外線激活皮膚中角質形成細胞和成纖維細胞的細胞表面受體，從而啟動信號轉導反應，導致細胞外基質中膠原蛋白的分解和新膠原蛋白合成的關閉[4]。紫外線誘導皮膚中ROS的釋放，激活了細胞表面細胞因子和生長因子受體來刺激眾多信號轉導途徑。UVA或UVB誘導活化（有時通過過氧化物或單線態O2作為信號分子）皮膚細胞中多種轉錄因子，包括因子激活蛋白1（AP-1）。AP-1誘導基質上調金屬蛋白酶（MMP），例如膠原酶-1（MMP-1）、基質溶酶-1（MMP-3）和明膠酶A（MMP-2），它們會降解結締組織，例如膠原蛋白和彈性蛋白，并間接抑制膠原蛋白的合成。膠原蛋白的破壞是光老化的標志。實驗證實，在紫外線照射后8小時內膠原蛋白的合成減少[5-7]。Fagot等[8]的研究揭示皮膚的UVA / UVB照射會在15 min內產生H2O2, 而H2O2能夠輕松穿越細胞膜，并與過渡Fe（II）結合，驅動高毒性羥基自由基的產生，從而引發細胞膜的脂質過氧化[9]。每次間歇性暴露于紫外線照射下，皮膚會退化并修復不完善，從而導致太陽光的積累疤痕和最終可見的光老化。雖然光老化的跡象似乎在一夜之間出現，但實際上它們隱藏在皮膚深層。皮膚受到紫外線的照射會引起氧化應激，導致發炎反應，例如急性紅斑和慢性損傷。慢性損害的后果包括過早的皮膚老化和皮膚癌[9-10]。

隨著現代電子科技的進步，除了陽光中的紫外線，我們被越來越多的“藍光”包圍著。最近的研究表明，藍光（400～500 nm）對皮膚也會造成傷害。研究發現，將細胞在光照與黑暗情況下進行觀察，光照組的線粒體呼吸活性降低了，嚴重破壞了線粒體DNA。這可能會導致細胞衰老，以及與年齡相關的病理和腫瘤的發生[11]。另有一項人體測試將9名健康志愿者暴露在藍光下，通過一種非侵入性的方式，測試到皮膚中類胡蘿卜素濃度有所下降，該研究表明，高劑量的藍光輻射對人類皮膚可能是一個相對不利的因素。皮膚中類胡蘿卜素的降解間接顯示了人體皮膚中產生的自由基，特別是活性氧的數量[12]。

除了使用化學或物理防曬劑來減少到達皮膚的紫外線強度外，向皮膚補充抗氧化劑并由此增強其抗氧化能力是限制ROS引起皮膚損傷的一種可行方法。為了抵消ROS的有害作用，皮膚配備了抗氧化劑系統，該抗氧化劑系統由多種抗氧化劑組成一個“抗氧化劑網絡”。非酶類抗氧化劑可分為脂質分子和水溶性分子。生育酚（VE）和β-胡蘿卜素（VA的前體）是主要的脂溶性非酶抗氧化劑。它們主要定位于細胞膜和LDL。VE的最活躍形式是α-生育酚，它可以打破自由基鏈反應。生育酚除了具有抗氧化作用外，還可抑制已經開始的脂質過氧化作用。β-胡蘿卜素主要通過激發單線態氧而與之相互作用。抗壞血酸（VC）是主要的水溶性非酶抗氧化劑。它與多種自由基在細胞內相互作用，并形成針對血漿中自由基的一線細胞外防御。研究表明，局部應用抗氧化劑提供了一種提高人表皮中抗氧化劑組織水平的有效方法[13]。

1 維生素A

類視黃醇家族包含維生素A（視黃醇）及其天然衍生物，例如視黃醛、視黃酸和視黃酯，以及合成衍生物。視黃醇是由20個碳原子組成的分子，由環己烯基環，連接4個雙鍵（均處于反式構型）的側鏈和一個醇端基組成，因此被稱為全反式視黃醇。視黃醇中醇端基氧化形成醛（全反式視黃醛或視黃醛），該醛可進一步氧化為羧酸（全反式視黃酸或維甲酸）。

這些脂溶性維生素不能人體合成，而且需要膽鹽、脂肪和胰脂肪酶來分解后才可以被人體吸收[14]。原維生素A的主要形式包括β-胡蘿卜素和視黃醇酯，它們被腸道消化吸收后，被運輸到肝臟并作為視黃酯形式儲存。在角質形成細胞中發現類視黃醇有兩種形式：視黃醇和視黃酯。這些親脂性的有機化合物對上皮細胞分化、免疫調節、生殖和視力都很重要[15]。

自1984年以來，全反式視黃醇已用于OTC化妝品。Kang等表明，在正常人皮膚上應用全反式視黃醇可誘導表皮增厚并增強CRABP II和CRBP mRNA和蛋白質的表達時，它在光老化治療中的潛力得以實現。已有的研究表明，視黃醇抑制紫外線誘導的MMP，并刺激光老化皮膚的膠原合成。在1998年首次進行了視黃醇制劑的對照臨床實驗，并觀察到使用視黃醇制劑治療12周后，皺紋得到顯著改善。隨后，研究了局部應用1%視黃醇在53例80歲或以上皮膚老化的效果，并觀察到視黃醇應用7天可降低基質MMP活性，金屬蛋白酶、膠原酶和明膠酶的表達伴隨著成纖維細胞生長和膠原蛋白的增加。因此得出結論，即視黃醇是治療老化和光老化的有效藥物[16]。光損傷的皮膚會表現出脆弱性和容易剪切或撕裂，本質上老化的皮膚也表現出這些特征。因此，人們懷疑基底膜區蛋白減少、表皮萎縮和血管脆弱性增加是導致這些變化的原因。局部視黃醇可以增加VII型膠原和微纖維，增加表皮和真皮之間的物理聯系。此外，血管生成和皮膚血流的增加可以改善皮膚炎愈合時間[17]。

2 維生素E及其衍生物

天然維生素E是一類脂溶性抗氧化物，可使生物膜（細胞膜、線粒體膜）避免發生脂質過氧化反應，使生物膜的信息傳遞、通透性、酶活力保持正常。維生素E在皮膚的角質層中尤其豐富，角質層作為人體的最外層防御，首先受到光和污染的氧化應激。通過這種暴露，維生素E會被消耗，因此局部應用特別有利。

維生素E（α-生育酚）的光保護作用已得到廣泛研究[18]。在動物研究中，暴露于紫外線下的維生素E可以顯著降低急性皮膚反應，如紅斑和浮腫、曬傷細胞形成、脂質過氧化、DNA加合物形成、免疫抑制以及UVA誘導的光敏劑結合。局部維生素E也減少了由于長期暴露于UVR而引起的皮膚腫瘤發病率。一項人體研究證明，通過測量色度計a*值（代表紅斑的發紅）和皮膚血流量，含有2%α-生育酚醇劑可顯著減少紅斑反應[19]。 在UVR暴露前30 min以2 mg /cm2的劑量涂抹乳液，由于該乳液沒有明顯的防曬性能，因此觀察到的光保護作用可能歸因于α-生育酚的抗氧化特性。臨床上，局部維生素E確實可以減少光老化產生的皺紋和日曬斑。在組織學上也證實了其存在光老化的逆轉：顯微鏡檢查顯示，維生素E能減少由紫外線引起的表皮肥大，角質層增厚，“曬傷細胞”增多的生理現象。進一步的電子顯微鏡分析證實了維生素E能對抗膠原蛋白和彈性蛋白纖維的損傷，并對紫外線誘導的基底膜錨定纖維破壞有修復作用[20]。

3 維生素C

維生素C，也稱作抗壞血酸，是一種α-酮內酯。在生理pH下，它以單價羥基陰離子形式存在，具有理想的自由基清除劑的許多特性。首先，它在人體中的很多組織中存在，并且供應充足。第二，它可以在細胞或某些組織內積聚。第三，在體內它可循環作用。抗壞血酸通過逐步提供兩個電子后，被氧化為脫氫-L-抗壞血酸（DHAA）。捐獻一個電子后的中間化合物是抗壞血酸自由基。DHAA可以被還原為抗壞血酸；該反應可以被DHAA還原酶催化，或者分解成2,3-二酮葡糖醛酸。第四，抗壞血酸是一種多用途的抗氧化劑，除單線態氧外，還可以與超氧化物和羥基自由基相互作用[21]。

皮膚中表皮層含有3.8 umol/g的維生素C，幾乎是真皮層的5倍之多。不過暴露于陽光和環境污染會損耗皮膚中的維生素C[22]。即使在紫外線照射計量為1.6MED（最小的紅斑劑量 ）的情況下，維生素C的水平也會降至正常水平的70%，而暴露于10 MED會使維生素C的水平僅為54%。在城市污染中暴露于10 mg/m3的臭氧會使表皮維生素C的含量降低55%[23]。

維生素C對皮膚有很多好處，最重要的是膠原蛋白的合成和光保護。維生素C是膠原蛋白合成過程中所需的脯氨酰羥化酶（穩定膠原蛋白分子）和賴氨酰羥化酶（產生結構強度交聯）兩種酶的必要輔助因子。通過增強膠原蛋白的合成，維生素C具有抗衰老作用。體外研究比較了新生和老年（80～95歲）成纖維細胞[24]，老年細胞在體外僅以新生細胞速率的五分之一增殖。但是，當將維生素C添加到培養基中時，老年細胞的增殖比正常新細胞好。新生成的成纖維細胞暴露于維生素C的情況下，也幾乎提高了4倍。人體測試中，將絕經后的婦女一側手臂和脖子使用5%的維生素C，而另一側則使用安慰劑，使用VC側的膠原蛋白I和III的mRNA表達增加[25]。最近的研究進一步表明，維生素C也可直接作用于DNA以增加轉錄速率并穩定前膠原信使RNA，從而調節和維持膠原蛋白的細胞間含量[26]。

維生素C雖然不是防曬劑，但是已被證明具有一定的光保護作用。在豬模型中，將10%的VC水溶液多次施用于動物皮膚，然后用400 mJ/cm2UVB照射，并在24 h后取樣。通過組織學確定曬傷細胞數，并觀察到治療和未治療皮膚的曬傷細胞數量均顯著減少[27]。但是，作為抗氧化劑，它可以使紫外線誘導的自由基失活，并使紫外線B紅斑減少52%。這種保護作用在組織學上得到了證實：局部用10%的維生素C處理可將異常的“曬傷細胞”數量減少40%～60%。每天用15%的維生素C，治療1年后，皺紋和斑駁的色素沉著明顯減少，皮膚獲得健康、年輕的光彩[28]。

4 維生素A、C、E混合使用的協同作用

Seite等[29]進行了兩項雙盲研究，局部應用視黃醇加維生素C組合對衰老或光老化皮膚的表皮和真皮的影響進行研究。兩項研究針對的是絕經后女性，這些女性是根據其自身面部皮膚的彈性變形水平進行選擇治療的。治療完成后，收集皮膚活檢樣品并進行處理，以進行組織學和免疫組織化學檢查。在第一個研究（皮膚老化）中，有8位志愿者每天兩次在一個肘部的內側施用含視黃醇和維生素C的制劑，在另一個肘部施用空白載體，每天兩次，持續3個月。治療后，我們觀察到表皮內部的組織學變化：角質層變薄，呈致密模式，而表皮增生增加，導致存活表皮增厚。在第二項研究（光老化皮膚）中，將11名志愿者分為兩組。 治療組使用含視黃醇和維生素C的制劑，對照組每天兩次將其涂在臉上，持續6個月。面部皮膚樣品呈現出光老化的組織學特征，即乳頭狀真皮中彈性物質的積累。經過6個月的局部治療后，觀察到的組織學變化主要集中在真皮水平。治療組和對照組均顯示出相似的I型膠原蛋白分布模式，但是，最初在光老化皮膚中觀察到的高含量III型膠原蛋白在視黃醇和維生素C治療組比例降低，而從使III型-I型膠原蛋白比較下降。此外，在視黃醇和維生素C治療組中，表皮下出現大量嗜酸性物質并形成更多更大的“genz區”。實驗結果表明，局部重復使用含有視黃醇和維生素C的制劑能夠部分逆轉自然老化和光老化引起的皮膚變化。

Burke[30]研究表明抗壞血酸還可以通過增強生育酚的活性來保護膜免受過氧化作用。通過體外研究表明，抗壞血酸降低了生育酚的自由基數量，從而恢復了生育酚的自由基清除活性，后者描述了抗壞血酸與生育酚結合的抗氧作用。在細胞中，維生素C和E協同相互作用以提供抗氧化保護。在膜中，維生素E被淬滅時會被過氧化的自由基氧化。鄰近的細胞內維生素C（氧化還原電位較低）可還原氧化的維生素E，以恢復其活性，因此無需在膜中進行置換。人體局部用L-抗壞血酸（15%）和α-生育酚（1%）對紫外線引起的紅斑有4倍的保護作用，減少了受損的“曬傷細胞”的數量。維生素C和維生素E結合褪黑激素對紫外線誘發的紅斑的保護作用在人體測試中得到了進一步證明。

Tesoriere等[31]觀察到全反式視黃醇和α-生育酚在單分子脂質體雙層中的顯著協同效應。胡蘿卜素和類維生素A被認為是非傳統的斷鏈抗氧化劑，因為它們不是通過提取H原子起作用，而是通過在共軛多烯鍵中添加過氧自由基（包括脂過氧自由基）來起作用，從而產生一個共振穩定的碳中心自由基。以碳為中心的自由基在兩個自氧化和一個抗氧化劑之間的分配將決定這些化合物有效清除過氧自由基的總體能力。當將全反式視黃醇單獨摻入脂質體系統中時，其表現出的抗氧化效果很差，這可以通過考慮全反式視黃醇的多烯鏈在脂質部分內部深處的位置以及脂質過氧化的自催化性質來解釋。自由基是通過AAPH從脂質雙層外部產生的，在脂質體表面上對脂質的快速攻擊會產生大量的支鏈化起始位點和脂質過氧化氫，然后才通過全反式視黃醇有效地清除脂過氧自由基。后者則主要通過自身氧化消耗。換句話說，在這種情況下，全反式視黃醇的抗氧化能力被湮沒。當生育酚和全反式視黃醇一起起作用時，視黃醇消失的時間過程會延長，同時脂質氫過氧化物的產生也隨之減少。該證據可能表明，通過保護全反式視黃醇免于自身氧化，生育酚可使視黃醇成為更有效的脂氧酰自由基清除劑。當添加的生育酚的含量遠低于胡蘿卜素時，在胡蘿卜素和生育酚之間的微粒體膜中未觀察到協同作用，而當抗氧化劑的含量大致相等時，抗氧化劑提供了協同保護作用。

5 結論

長期暴露于紫外線和藍光下的皮膚會發生光老化，皮膚變得粗糙、暗沉、失去彈性，甚至有患皮膚癌的風險。除了使用防曬劑來吸收紫外線之外，大量的體外和人體實驗表明，一些維生素及其衍生物可以抵御光老化，而且它們組合使用的效果可以大大提升。聯合使用VA、VC和VE不僅可以大大降低光照產生的ROS，同時還可以增加皮膚合成膠原蛋白的能力。這種多維的方式可提升抵抗光老化的能力。不僅如此，在產品中使用“天然”光保護劑可以降低合成防曬劑的用量，從而降低對皮膚的刺激，同時達到事半功倍的效果。