脊髓肌萎縮癥產前分子篩查臨床應用并策略分析

劉春苗，孫東蘭，于 湄，張 靜，楊玉秀，孟雁欣*

(1.河北省石家莊市第四醫院產一科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第四醫院產前診斷中心，河北 石家莊 050011)

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)是一組脊髓前角及腦干運動神經元變性、丟失，導致的以緩慢進行性加重、肢體近端對稱性肌無力、肌萎縮為主要臨床表現的遺傳性骨骼肌疾病，呈常染色體隱性遺傳[1]。95%的SMA由運動神經元生存基因(survival motor neuron,SMN)拷貝缺失致病，5%SMN點突變致病。嬰幼兒、青少年為主要發病人群。群體發病率1/6 000～1/10 000，攜帶頻率1/35～1/42，無明顯地域及人口種族差異性[2-3]。SMA存在診斷分型難，兒童發病、致死率高、藥物治療費用極高且治療手段有限等科學問題。全美醫學遺傳學會推薦將SMA攜帶者產前篩查納入常規孕前檢查項目[4]。本研究以分子生物學方法對4 568例樣本進行SMA攜帶者篩查，并建立SMA分子生物學診斷、鑒別診斷平臺同時完善該病產前策略，報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2017年1月—2018年12月因孕前檢查于石家莊市第四醫院產前診斷中心就診的患者4 568例，女性2 480例，男性2 088例，對檢出的攜帶者配偶126例及夫婦雙方均為攜帶者25對孕期胎兒行針對性檢測。

本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意且簽署知情同意書。

1.2介入性產前診斷 孕婦取仰臥位，常規消毒鋪巾，超聲定位穿刺部位。孕12周孕婦13例行絨毛穿刺術，由專人超聲引導下經腹部或經陰道抽取妊娠絨毛組織25 mg；余孕18周后行羊水穿刺術，由專人經腹部抽取羊水30 mL。

1.3分子生物學方法

1.3.1DNA提取、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增 抽取3 mL外周血，天根DNA提取試劑盒獲得基因組DNA。

羊水細胞培養，7 d后以生理鹽水反復沖洗5～6次貼壁羊水細胞并進行細胞收集，應用天根DNA細胞基因組試劑盒提取胎兒羊水細胞基因組DNA。NanoDrop1000微量核苷酸蛋白多功能酶標儀(美國Gene公司)定量分析(OD260/OD280比值1.8～2.0)，-80 ℃保存余DNA樣本。Prime 6軟件設計引物，覆蓋SMN1/KRIT1/CYBB全長，包括目的基因片段各個外顯子及與內含子交界區，Pubmed blast比對引物(表1)。KRIT1/CYBB為內參基因。PCR擴增參數：95 ℃ 10 min熱啟動預變性，95 ℃ 30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 60 s，共25個循環，72℃充分延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min。

1.3.2Denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC)分析 樣本完成PCR擴增進行DHPLC檢測。5 μL PCR反應樣本上機(美國環球基因公司)，選擇類型DS Multiple Fragment，溫度50 ℃，上樣、洗脫。應用儀器自帶軟件計算SMN1/KRIT1比值，SMN1/KRIT1等于0純合缺失，雜合缺失或攜帶為0.5，正常人為1。以SMN1/KRIT1比值作為校正系數，所有比值按照校正系數進行比對后得出數據。

1.3.3Sanger法測序 美國ABI 3730XL(Applied Biosystems,Foster City,CA)自動測序儀測序。Sequencher v4.1(Gene Codes,Ann Arbor,MI,USA)比對分析，致病變異位點進行家系成員靶向檢測分析。分析變異序列與疾病表型有無共分離現象，進行基因變異位點定位、明確氨基酸變化及功能改變。

2 結 果

2.1DHPLC檢測結果 研究以DHPLC方法對入選4 568例樣本進行SMN 1外顯子進行拷貝缺失檢測，2例SMN1外顯子7/8純合缺失(SMA患者)，父母雙方驗證SMN1外顯子7/8雜合缺失，拷貝數“1”(典型SMA攜帶者)，余樣本中未見SMN1外顯子7及外顯子8純合缺失；共計檢測到攜帶者126例，攜帶頻率1/36，其中SMN1外顯子7/8雜合缺失84例，拷貝數均為“1”，僅SMN1外顯子7拷貝數“1”31例，單獨SMN1外顯子8拷貝數“1”11例，致病基因攜帶頻率1/40。聯系并告知上述攜帶者配偶并在其知情同意基礎上對其抽取外周血進行SMN 1外顯子拷貝變異檢測，25例配偶樣本證實為SMN1外顯子7/8雜合缺失，即拷貝數均為“1”，致病攜帶率1/50(圖1)。

圖1 DHPLC檢測SMN1缺失檢測

2.2Sanger測序檢測結果 研究對4 568例樣本進行SMN1點突變變異檢測，明確1例SMN1外顯子7/8雜合缺失攜帶者拷貝數為“1”樣本同時攜帶p.Q164X點突變變異位點，臨床診斷為“1+1型”SMA患者，告知該樣本父母檢測結果并知情同意前提下對父母行SMN1缺失及點突變檢測，證實其母為SMN1外顯子7及外顯子8雜合缺失攜帶者，其父親為p.Q164X點突變攜帶者(圖2)。余樣本(含拷貝缺失攜帶者配偶)未檢測出致病意義明確變異位點。

圖2 SMN1 Sanger測序分析結果

2.3SMA攜帶者高危胎兒產前診斷 研究對上述SMA攜帶者中25對夫婦(含點突變夫婦)胎兒于孕18周行羊水穿刺，并應用DHPLC及Sanger測序技術進行SMN1拷貝數及點突變變異檢測。結果顯示SMN1外顯子7/8純合缺失(SMA患者)胎兒3例；SMN1外顯子7/8雜合缺失(SMA攜帶者)胎兒1例。余胎兒檢測未見SMN1拷貝數異常(圖3)。Sanger測序1例胎兒攜帶p.Q164X點突變變異位點，余樣本未見SMN異常。

圖3 DHPLC對SMA攜帶者高危胎兒SMN1檢測分析

3 討 論

SMA是僅次于杜興型肌營養不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)常見的神經骨骼肌疾病，也是目前已知除囊性纖維變外最常見致死性極高的常染色體隱性遺傳病。美國食品藥品監督管理局于2019年批準首個治療SMA基因治療藥物Zolgensma(onasemnogene abeparvovec-xioi)上市并應用于臨床，但1劑用藥212萬美元的高昂費用且僅針對2歲以下兒童用藥范圍限制了其短期內臨床普及進度[5-6]。因此，臨床對先證者早期診斷及攜帶者早期篩查有重要意義。既往研究證實[7-8]：①染色體5q11.2-q13.3區域SMN變異導致脊髓前角細胞與腦干內運動核進行性變性為其發病機制；②SMA是嬰兒期最常見致死性遺傳病；③肌電圖、肌酶和肌肉活檢診斷特異度不高，分子生物學診斷檢測“金標準”；④“SMA 0型”被報道，遺傳學超聲可見宮內胎動明顯減少，如不及時采取措施，1歲內即死亡。上述特征為SMA臨床診斷、分型、治療、預防提出了難題。分子生物學技術逐漸成為不可取代的診斷、分型SMA“金標準”。悉數SMA分子檢測手段，由最初的聚合酶鏈-單鏈構象多態性分析、限制性片段長度多態性分析、DHPLC、PCR技術、到多重連接依賴式探針擴增(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)[9]，技術手段各有優劣，尋找精準、有效、經濟的分子檢測手段成為臨床醫生關注的焦點。

我國學者對338例SMA疑似患兒行PCR-RFLP分析中發現267例為純合缺失，另外88例中17例符合SMA國際診斷標準，經過DHPLC驗證為雜合缺失；同時有研究證實在對85例臨床疑似SMA患兒進行PCR-RFLP分析57例考慮純合缺失，另外19例陰性患兒后期隨訪過程中發現并不符合SMA診斷。由此我們不難發現單獨依靠PCR-RFLP容易造成SMA誤診、漏診，同時單將限制性片段長度多態性分析用于產前診斷無法準確判斷母源污染而存在假陰性率。與PCR-RFLP技術相比，DHPLC是一類單核苷酸多態性研究中常見技術，能明確患兒及其親屬SMN缺失、雜合缺失情況并解決酶切不完全、限制酶失效等問題，此外還具備成本低、檢測快速、通量高等優勢[10]。本研究基于SMA流行病學報道及發病特征，選擇DHPLC進行檢測，同時結合單基因靶向測序技術進行“點突變”致病位點檢測篩查，二者有效結合，防“漏篩”同時有效降低消耗成本。

研究結果中128例SMN 1拷貝異常樣本中2例明確SMA，余126例攜帶者，攜帶頻率1/36，與1/35～1/168不同人群攜帶波動頻率比較[11]，我省地區攜帶頻率與歐美國家及我國南方人群(含臺灣地區)遺傳流行病學研究報告攜帶頻率1/25～1/50較為一致。眾所周知，SMN1中外顯子7決定SMA臨床表型及致病意義，SMA患者SMN1一般表現為外顯子7、8同時缺失或僅外顯子7純合缺失。SMN1中外顯子8缺失與否并不能導致SMN1編碼蛋白結構及功能的改變，而且鮮有SMN1外顯子8缺失致病報道[12]，因此SMN1外顯子7缺失被公認為SMA致病原因。但SMA患者SMN1與SMN2轉化過程中會引起外顯子8的多態性改變，因此8號外顯子缺失通常作為后期隨訪及觀察組，也是SMN1基因缺失中不可缺少的分析位點[13]。

測序技術是SMN1缺失檢測有效補充，既可以對患者進行疾病熱點突變位點-臨床表型分析也可以靶向判斷堿基改變，對新發變異突變位點與遺傳病間關系研究起著不可替代的作用。本研究1例“1+1”型SMA樣本Sanger測序結果顯示位于6號外顯子無義突變位點p.Q164X為亞洲人群首報且經蛋白水平檢測致病意義明確。迄今，已發現的點突變致病位點約30余個且多分布于3號/6號外顯子[13]，本研究證實6號外顯子為“熱點突變”占據地。這一檢測結果填補了中國SMA點突變基因數據庫。該SMA患兒臨床發病晚、癥狀輕，僅表現雙下肢肌力減退及遠端肌輕度萎縮。Wu等[14]指出SMA患者臨床表型嚴重程度除與SMN1與SMN2“劑量補償”有關，“1+1型”患者臨床表型與“點突變”類型密切相關，如無義突變致病較輕微，而嚴重的1型患者多與移碼突變相關。我們對樣本親緣驗證示SMN1缺失變異源自其母，p.Q164X源自其父。該驗證結果與約2%新發點突變變異位點中大部分源于父系報道一致[15]。因此，點突變測序技術是SMA分型診斷必不可少的檢測途徑。

基因篩查與基因診斷最大的區別就是應用人群及檢測目標的差異，但卻有著相同的遺傳學基礎及極為相似的檢測手段，因此人群攜帶者篩查最終落實的實際意義在于指導高危家庭的遺傳咨詢、妊娠及如何規避缺陷患兒出生。SMA作為AR遺傳病符合孟德爾遺傳定律，即如夫婦雙方均為攜帶者，子代表現為25%發病，50%攜帶，25%正常[16]。本研究對前期明確25對SMA攜帶者夫婦胎兒行介入性產前診斷SMA占12%，攜帶率達8%。該數據證實SMA產前篩查及產前診斷極為重要，實際臨床工作中醫療環境及醫生認識問題使部分醫生忽略SMA攜帶者篩查指導及產前策略分析。

目前已知SMA患兒防治技術主要有：①SMA無創產前診斷，通過檢測孕婦外周血中胎兒游離DNA及對孕婦中胎兒有核細胞進行富集后而進行的胎兒遺傳學診斷；②通過胚胎植入前遺傳學診斷技術對胚胎基因組變異進行明確診斷并剔除不良胚胎；③基于攜帶者篩查基礎上于孕中期行胎兒產前診斷[17-19]。顯然，產前診斷是最精準、經濟、有效的手段。那么在我國什么樣的人群適合SMA攜帶者篩查呢，當然，對于各項醫療保障制度完善的地區我們提倡“譜篩”，指導攜帶者夫婦遺傳咨詢及生育并選擇產前診斷最佳時機；對于無條件執行譜篩的醫療條件下我們建議對下列人群靶向進行SMA攜帶者篩查：①既往生育過SMA患兒的夫婦；②遺傳學超聲提示胎兒胎動少，伴有室間隔缺損及四肢姿勢固定、關節攣縮的影像學表現；③夫婦雙方家系中均有SMA發病病史的；④夫婦雙方一方攜帶者或患者欲生育的；⑤先證者經基因診斷明確的高危產婦的。Chen等[20]對SMA篩查評估證實SMA患兒從2003年90.62%逐漸下降到2014年的20.83%，且檢測結果益處大于弊處。由此可見，精準篩查、嚴格把控篩查指征及科學嚴謹遺傳指導可有效降低SMA缺陷患兒的出生，造福人類。

綜上所述，SMA攜帶者篩查可謂是預防措施的“雙刃劍”。SMA精準的篩查可以降低SMA患兒的出生，提供有效的遺傳咨詢信息，如預測不同人群地區種族的攜帶及發病頻率，更可作為遺傳評估手段用于輔助生殖，使家庭再次生育健康孩子的愿望得以實現。我國學者Tisdale等[17]早期曾建立了對先證者進行拷貝及點突變檢一套完整檢測系統，指出建立完整的SMA攜帶者篩查流程在該病預防及遺傳咨詢中有重要作用，因此我們認為完善的攜帶者篩查分析進行拷貝缺失、點突變檢測分析固然重要，但對于種族及地區間的差異分析也是評估攜帶者篩查的重要因素。本研究通過上述人群研究總結出河北地區人口SMA人群攜帶頻率及發病頻率。明確攜帶者基礎上，進行規范遺傳咨詢及生育指導。