甘薯脫毒和組培快繁技術研究初探

張 秦 楊會苗 劉蘭英 張軍民 李春玲

（北京市海淀區植物組織培養技術實驗室/北京市植物組織培養工程技術研究中心 北京100091）

甘薯（Ipomoea batatasLam.）又稱山芋、番薯、紅薯、地瓜，為旋花科甘薯屬一年生或多年生蔓性草本植物，耐旱，耐貧瘠，產量高，富含多種營養物質，具有良好的保健功能。我國的甘薯種植面積及產量均居世界首位，主要用作糧食、飼料及工業原料，在國家糧食安全與能源安全方面占有重要地位。病毒病是甘薯的主要病害之一[1-2]，一旦感染病毒，會導致產量品質降低，種性退化，嚴重者可導致減產[3]。為提高甘薯脫毒率，滿足脫毒苗產業化生產的需求，筆者對甘薯莖尖培養、高溫和藥劑3種脫毒方法進行了研究；對繁殖速度慢的甘薯品種進行了增殖培養基的篩選試驗，以提高繁殖速率，短期內獲得大量的脫毒組培苗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗甘薯品種為煙薯25、京6、濟薯26、普薯32，由北京市農業技術推廣站及北京市密云區和合元種植專業合作社提供。本試驗于2018－2020年進行。

1.2 試驗材料準備

準備大號塑料缽，底部鋪設報紙，以防澆水時基質隨水從排水孔中流出；栽培基質選用蛭石和草炭，比例2∶1；基質提前用500倍百菌清溶液噴濕，將薯塊平鋪或直插入基質中，注意直插時分清上下部，澆水后放于適宜溫度下催芽。催芽溫度條件29～32℃。待苗出芽后降低溫度，控制在25～28℃。

從攜帶有SPLCV病毒的煙薯25盆栽苗上剪插條，插條長約10 cm，去除葉片，插條上部平切，下部斜切；將插條放于500倍百菌清溶液中浸泡10 s，再用濃度為100～500 mg/kg萘乙酸溶液處理，以利快速生根；扦插基質為蛭石和草炭，扦插容器選用塑料缽，從底部到上部依次為報紙、草炭、蛭石，同樣用500倍百菌清溶液處理；將處理好的插條扦插于基質中，噴水后放置于25～28℃的環境條件下培養。待生根并長出新芽后即可進行藥劑脫毒試驗。

1.3 莖尖剝離技術

1.3.1 材料準備 當甘薯塊莖長出新芽后，切下頂部約2 cm的芽段，剪去已展開的葉片放入燒杯中，倒入洗滌靈進行洗滌，用流水沖洗30 min左右，置于超凈工作臺上。在超凈工作臺內先用酒精處理30 s，再用0.2%升汞或5%次氯酸鈉進行消毒，倒去消毒液后，用無菌水沖洗3～5次，將芽段放在滅過菌的濾紙上吸干水分。

1.3.2 莖尖培養 在解剖鏡下對芽段進行處理，剪去較小未展開葉片和較大的葉原基，切下帶有1～2個葉原基的生長點，長度為0.2～0.3 mm，用解剖針將莖尖挑到裝有培養基的三角瓶中進行培養，每瓶接種3～5個外植體，每接種一個莖尖換一次手術刀及解剖針，以降低污染。培養基為“MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA”，培養基中附加30 g/L蔗糖和6 g/L瓊脂，pH 5.8。培養條件為溫度25℃、光照強度2 000 lx、光照時間12 h/d。培養30 d后轉到MSO培養基。

1.4 高溫處理結合莖尖剝離技術脫毒

剝離煙薯25與京6莖尖，莖尖剝離方法參照上文所述，統計脫毒效果；將未脫除病毒的煙薯25與京6莖尖組培苗置于40℃恒溫箱分別處理2 h、4 h、8 h，之后進行病毒檢測，并統計脫毒效果。

另對營養缽中的煙薯25直接進行高溫處理，處理溫度35～40℃，處理時間為30 d，參照上文所述方法進行病毒檢測并統計脫毒效果。

1.5 藥劑結合莖尖剝離技術脫毒

以攜帶有SPLCV病毒的煙薯25盆栽苗為試驗材料，進行藥劑脫毒試驗。即在甘薯植株上噴藥，處理1 d后剝取帶1～2個葉原基的莖尖進行分生組織剝離和培養，方法參照上文所述。脫毒藥劑為寧南霉素、毒氟磷、新奧甘肽、阿泰靈；處理濃度為寧南霉素3.33 ml/L、毒氟磷3.33 g/L、新奧甘泰1.33 ml/L、阿泰靈3.33 g/L；待愈傷生成不定芽，轉至MSO培養基成苗后，再進行病毒檢測。病毒檢測參照下文。

1.6 病毒檢測

病毒檢測方法采用RT-PCR檢測技術。檢測病毒種類共7種，分別為甘薯褪綠斑病毒（SPCFV）、甘薯褪綠矮化病毒 （SPCSV）、甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）、甘薯卷葉病毒（SPLCV）、甘薯病毒2號（SPV2）、甘 薯 病 毒G（SPVG）和 甘 薯 潛 隱 病 毒（SPLV）。病毒引物見表1。

1.7 增殖培養基篩選

以煙薯25、濟薯26、普薯32為材料，轉接于不同培養基中，以探求適宜甘薯快繁的最佳增殖培養基。每瓶4棵，20棵為1個重復，共3次重復，60棵為1個處理。

培養基：①MS；②MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT；③MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT。

以上培養基中添加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L。

2 結果與分析

2.1 莖尖培養結合高溫處理脫毒結果

莖尖培養與脫毒情況如表2所示，煙薯25與京6莖尖出苗率分別為80.0%、56.2%；莖尖成苗后選取部分植株進行7種病毒檢測，檢測結果顯示，煙薯25與京6病毒脫除率分別為28.6%、0。

高溫處理脫毒結果如表3所示，煙薯25與京6在40℃條件下處理2 h、4 h、8 h后，SPFMV病毒脫除率均為100%；煙薯25攜帶的SPLCV病毒，處理2 h、8 h均可100%脫除，而處理4 h，不能完全脫除，脫毒率為66.7%；京6攜帶的SPLCV病毒在40℃條件下經2 h、4 h、8 h處理，脫毒率均為85.7%。由此推斷，40℃條件下分別處理2 h或8 h可有效脫除煙薯25中SPFMV及SPLCV病毒。處理時間的長短對京6中SPFMV及SPLCV病毒的脫除無明顯影響。

表1 引物序列

表2 不同甘薯莖尖培養和脫毒結果

塑料缽中種植的攜帶有SPFMV及少量SPLCV病毒的煙薯25高溫處理之后的病毒檢測結果顯示，SPFMV病毒已被脫除，但仍攜帶SPLCV。由此可知，35～40℃，處理時間30 d可有效脫除SPFMV病毒。

2.2 藥劑處理結合莖尖培養脫毒結果

由表4可知，4種藥劑處理之后的莖尖成苗率相差較大，寧南霉素處理的成苗率最低，為25.0%；其他均高于80%。脫毒效果較好，均為100%，說明莖尖培養與脫毒藥劑共同處理對SPLCV病毒有明顯脫除作用。

2.3 不同激素對甘薯生長發育的影響

由表5可知，煙薯25在3種培養基中葉片顏色均是綠色，生長健壯，株高、節間數、葉片數相差不大，但是在2號培養基中萌發芽數較1號、3號培養基要多；普薯32在1號培養基中葉片呈淺綠色，植株較為細弱，在2號、3號培養基中葉片濃綠色，莖稈粗壯，成紅色；在植株高度、節間數與葉片數量上，2號、3號培養基中的甘薯明顯高于1號，而在分化芽的數量上相比，2號培養基又高于3號培養基。濟薯26在3種培養基上的生長狀況相比，1號培養基中的甘薯葉片呈淺綠色，植株較為細弱；在2號、3號培養基中葉片更為濃綠，莖稈粗壯，呈紅色，且在植株高度、節間數、分化芽的數量方面明顯要高于1號培養基。綜上所述，煙薯25、普薯32、濟薯26在2號培養基中更適宜擴繁增殖。

表3 高溫處理對不同甘薯脫毒率的影響（單位：%）

表4 不同藥劑對煙薯25莖尖培養與脫毒率的影響

3 結論與討論

在農業生產中的植物病害中，病毒危害最為嚴重。植物病毒一般是通過病葉汁液、各種昆蟲介體、真菌、土壤及種子傳毒[4]。甘薯是無性繁殖植物，一旦感染病毒，其種性、品質、產量等都會受到影響，且逐年加重[3]。為了防止甘薯病毒病的危害，現在多采用莖尖培養、熱處理、抗病毒藥劑脫毒法進行防治。

表5 不同濃度激素對甘薯生長發育的影響

本研究中利用莖尖培養脫毒的方法處理煙薯25與京6，莖尖出苗率分別為80.0%、56.2%；7種病毒脫除率分別為28.6%、0。辛國勝[5]等以煙薯25為材料，在室內和田間條件下，進行不同莖尖剝離方式對比試驗，研究發現常規莖尖剝離技術脫毒率為25%，而采用“一刀切”的莖尖剝離技術病毒脫除率可達50%，且莖尖成苗率也比常規剝離技術高429.7%。本研究中利用莖尖培養技術的煙薯病毒脫除率與辛國勝等研究中利用常規剝離技術的脫除率相差不大，但明顯低于“一刀切”剝離技術，因此在之后的研究中，可嘗試“一刀切”的莖尖剝離技術以提高莖尖成苗率和脫毒率。

在高溫處理試驗中，煙薯25攜帶的SPFMV與SPLCV病毒在40℃高溫條件下處理2 h、4 h、8 h后，SPFMV病毒全部脫除；但SPLCV病毒，處理2 h、8 h均可脫除，處理4 h不能完全脫除，對于出現這種結果的原因還需要進一步的探索研究。盆栽煙薯25于35～40℃處理30 d可有效脫除SPFMV。京6攜帶的SPFMV與SPLCV病毒在40℃高溫條件下處理2 h、4 h、8 h后的脫除效果相同，并不受處理時間限制。

藥劑脫毒法主要是通過藥劑處理競爭寄主細胞表面受體，提高寄主抗病性，阻礙病毒穿入、病毒生物合成以達到抑制病毒的目的[6]。病毒唑是應用較多的病毒抑制劑。

在本研究中利用莖尖培養與毒氟磷、阿泰靈、寧南霉素、新奧甘泰4種藥劑進行脫毒處理研究發現濃度為3.33 g/L毒氟磷、3.33 g/L阿泰靈、3.33 mL/L寧南霉素、1.33 mL/L新奧甘泰結合莖尖處理能夠有效脫除煙薯25中的SPLCV病毒。而該種脫毒方法對煙薯25中其他病毒或其他甘薯品種的病毒脫除效果還需要進一步研究。

在本研究中通過含不同激素的培養基篩選試驗，發現MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT較適宜煙薯25、普薯32、濟薯26組培苗擴繁，能在短時間內獲得大量脫毒苗。