我國(guó)部分地區(qū)羊駝十二指腸賈第蟲(chóng)的PCR 檢測(cè)和鑒定

黃玫瑰，張齊元，汪 文，2，徐春艷，侯旻昱，王 甜，井 波*

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室新疆阿拉爾 843300；2.阿克蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆阿克蘇 843000）

十二指腸賈第蟲(chóng)（Giardia duodenalis）是人和動(dòng)物常見(jiàn)的人獸共患腸道寄生原蟲(chóng)，宿主范圍廣泛[1]。家畜、寵物和野生動(dòng)物等動(dòng)物糞便中的十二指腸賈第蟲(chóng)包囊常污染水源和食物，導(dǎo)致人畜賈第蟲(chóng)病的暴發(fā)和流行[2]。基于遺傳進(jìn)化研究，十二指腸賈第蟲(chóng)至少分化為8個(gè)（A-H）集聚體，集聚體A 和B 是人獸共患集聚體，主要感染人和多種動(dòng)物，而其他集聚體則多存在宿主特異性[1,3]。我國(guó)自2002 年首次從澳大利亞引種羊駝，隨后建立多個(gè)基地進(jìn)行繁育和推廣，用于毛紡業(yè)、觀光業(yè)和旅游業(yè)的發(fā)展，甚至部分作為寵物，與人接觸密切[4]。1987 年，在美國(guó)威斯康星州首次報(bào)道大羊駝感染十二指腸賈第蟲(chóng)，隨后陸續(xù)在美國(guó)、秘魯和澳大利亞等國(guó)家均有美洲駝感染十二指腸賈第蟲(chóng)的報(bào)道[5-8]，而我國(guó)有關(guān)羊駝感染十二指腸賈第蟲(chóng)的研究資料較少。本試驗(yàn)采用PCR 法檢測(cè)我國(guó)不同地區(qū)羊駝的感染情況和鑒定基因型，以期為羊駝賈第蟲(chóng)病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

分別于2016 年8 月至2017 年7 月和2019 年7 至8 月收集塔城市、溫宿縣、和靜縣、青河縣、尼勒克縣、青島市、繁峙縣、代縣和陽(yáng)曲縣養(yǎng)殖基地的羊駝糞便（20～30 g）樣本484份，帶回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃冷藏箱保存。羊駝多數(shù)為成年母駝，采集樣本時(shí)均未見(jiàn)腹瀉。

1.2 DNA提取

每份糞便樣本在自封袋內(nèi)充分揉勻后，分別用一次性筷子挑取約300 mg，置于潔凈的2 mL 離心管內(nèi)，使用糞便全基因組DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.?D4015-02，美國(guó)OMEGA Bio-Tek 公司生產(chǎn)），按照說(shuō)明書(shū)步驟操作提取200 μL DNA，置-20 ℃保存。

1.3 PCR擴(kuò)增

參考Appelbee 等[9]的十二指腸賈第蟲(chóng)小亞基核糖體RNA（SSU rRNA）基因引物序列。引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。其中，第一輪上游序列為5'-AAGTGTGGTGCAGACGGACTC-3'，下游序列為5'-CTGCTGCCGTCCTTGGATGT-3'，目的片段為497 bp；第二輪上游序列為5'-CATCCGGTCGATCCTGCC-3'，下游序列為5'-AGTCGAACCCTGATTCTCCGCCAGG-3'，目的片段為299 bp。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板DNA 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、rTaq酶0.15 μL、上下游引物（20 μmol/L）各0.3 μL、二甲基亞砜（DMSO）1.25 μL、雙蒸水17.5 μL。第一輪和第二輪的退火溫度分別為55 ℃和59 ℃。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μLPCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)中檢查結(jié)果。

1.4 測(cè)序與序列分析

PCR 擴(kuò)增出目的片段的產(chǎn)物，委托蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)定序列進(jìn)行拼接，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 搜索，應(yīng)用Clustal X 2.11軟件對(duì)所獲序列進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊駝十二指腸賈第蟲(chóng)感染情況（見(jiàn)圖1、表1）

圖1 十二指腸賈第蟲(chóng)SSU rRNA基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplication based on SSU rRNA gene of G.duodenalis

由圖1、表1 可知，對(duì)484 份羊駝糞便樣本DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，有8 份擴(kuò)增出目的片段條帶，十二指腸賈第蟲(chóng)總感染率為1.7%。9個(gè)養(yǎng)殖基地中，溫宿縣、和靜縣、青河縣、尼勒克縣、代縣和陽(yáng)曲縣羊駝十二指腸賈第蟲(chóng)感染率分別為3.0%、5.0%、2.9%、8.3%、2.6%和0.5%；而塔城市、青島市和繁峙縣的羊駝均未發(fā)現(xiàn)十二指腸賈第蟲(chóng)感染。

表1 我國(guó)不同地區(qū)羊駝十二指腸賈第蟲(chóng)感染情況Tab.1 Infection of G.duodenalis in alpaca in different collection sites in China

2.2 十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體鑒定

擴(kuò)增出的8 個(gè)十二指腸賈第蟲(chóng)陽(yáng)性樣本均成功雙向測(cè)序，序列比對(duì)分析結(jié)果表明，5 條序列與我國(guó)馬源十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體A（序列登錄號(hào)：MN174121）同源性為100%，鑒定為集聚體A；3 條序列與我國(guó)猴源十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體B（KJ888984）同源性為100%，鑒定為集聚體B；8 個(gè)樣本均為人獸共患集聚體。

3 討論

2008 年，Trout 等[6]對(duì)美國(guó)馬里蘭州的羊駝十二指腸賈第蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)感染率為4.9%。Gomez-Puerta等[5]和Gómez-Couso等[7]分別于2012年和2014年對(duì)秘魯羊駝的十二指腸賈第蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)感染率較高，分別為13.0%和50.0%。2018 年，Koehler 等[8]報(bào)道澳大利亞不同羊駝群的十二指腸賈第蟲(chóng)的感染率為7.4%。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)羊駝十二指腸賈第蟲(chóng)感染率為1.7%，低于秘魯、美國(guó)馬里蘭州和澳大利亞等地羊駝十二指腸賈第蟲(chóng)的感染率，可能與調(diào)查中的樣本多來(lái)自成年羊駝?dòng)嘘P(guān)。在秘魯?shù)囊豁?xiàng)調(diào)查顯示，小于1月齡羊駝和成年羊駝的感染率分別為33.3%和1.8%，存在顯著的年齡差異[5]。目前，我國(guó)多數(shù)羊駝養(yǎng)殖基地多是引種、擴(kuò)繁和銷(xiāo)售模式，幼齡羊駝在基地中相對(duì)較少。在今后的調(diào)查中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)幼齡羊駝的調(diào)查。

十二指腸賈第蟲(chóng)的8種集聚體（A-H）中，集聚體A和集聚體B為人獸共患集聚體，具有廣泛的宿主，可通過(guò)污染水源感染人和動(dòng)物[1-2]。在馬里蘭州的調(diào)查顯示，3份羊駝陽(yáng)性十二指腸賈第蟲(chóng)樣本均為集聚體A[5]；在秘魯?shù)恼{(diào)查顯示，46 份羊駝羊駝陽(yáng)性十二指腸賈第蟲(chóng)樣本37 份為集聚體A，9份為集聚體E[6]。在秘魯?shù)牧硪豁?xiàng)調(diào)查顯示，基于2個(gè)基因位點(diǎn)，對(duì)137個(gè)羊駝十二指腸賈第蟲(chóng)顯微鏡鏡檢陽(yáng)性樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，成功獲得92 條序列，其中，67 條為集聚體A，24 條為集聚體E，1 條為集聚體A 和E 混合感染[7]。在澳大利亞的調(diào)查顯示，6 份羊駝羊駝陽(yáng)性十二指腸賈第蟲(chóng)樣本5份為集聚體A，1份為集聚體E。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)不同地區(qū)羊駝感染的十二指腸賈第蟲(chóng)以集聚體A 為優(yōu)勢(shì)集聚體，與上述報(bào)道的調(diào)查結(jié)果相一致；同時(shí)發(fā)現(xiàn)羊駝可感染集聚體B，是否還感染其他集聚體有待于進(jìn)一步調(diào)查研究。

4 結(jié)論

調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)部分地區(qū)羊駝十二指腸賈第蟲(chóng)感染率較低，存在人獸共患集聚體A 和集聚體B，提示具有潛在的人獸共患風(fēng)險(xiǎn)。