規(guī)模化鵝場致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測

張瑀琪，蘇玉銘，王芷晴，劉海月，李欣南，于麗玲，李 寧，戴成杰，李 冰，周鐵忠，劉英姿*

（1.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧錦州 121001；2.大石橋市農業(yè)農村事務中心，遼寧大石橋 115100；3.遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧沈陽 110032；4.瓦房店市動物疫病防控中心，遼寧大連 116300；5.遼寧省農業(yè)發(fā)展服務中心，遼寧沈陽 110032；6.朝陽縣畜牧技術推廣站，遼寧朝陽 122000）

鵝大腸桿菌病是由大腸埃希菌（Escherichia coil）致病菌株引起的臨床常見鵝細菌病之一,主要表現(xiàn)局部或全身癥狀，不同日齡不同型病例表現(xiàn)不同，常見有孵化中死胚、卵黃性腹膜炎、敗血癥等，由垂直傳播或經消化道、呼吸道等多種渠道感染，一年四季均可發(fā)生[1]。近年來，養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖密度提高，鵝大腸桿菌病發(fā)病率及死亡率逐年上升。因抗生素的濫用，鵝大腸桿菌的耐藥性不斷增強，為臨床治療帶來困難，造成養(yǎng)殖戶經濟損失[2]。本試驗以遼寧省黑山縣某發(fā)病鵝場作為研究對象，進行鵝致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析，為鵝大腸桿菌病的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2020年7月10日遼寧省黑山縣某鵝場15日齡雛鵝及180 日齡雌鵝發(fā)病。該場飼有東北小白鵝6 000 只。雛鵝發(fā)病率35%，死亡率29%。雛鵝表現(xiàn)精神沉郁、排灰白色稀糞、眼結膜潮紅、頭面部腫脹；剖檢可見腹水、氣囊混濁、包心包肝、多臟器粘連等。產蛋鵝產蛋率下降50%，表現(xiàn)厭食、精神沉郁；剖檢可見卵黃性腹膜炎。選取具有典型癥狀病鵝4 只，無菌采集8 份病料，冷藏箱保存，24 h 內送至實驗室檢測。

1.2 試劑及動物

試劑：微量生化反應管（杭州天和微生物試劑有限公司）、細菌基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）

動物：20日齡體重（20±2）g SPF級昆明小鼠50只，購自錦州醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌的分離培養(yǎng)、純化及鏡檢

無菌條件下，將病料接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，挑取優(yōu)勢菌落，再次接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。革蘭氏染色陰性短小桿菌的純菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取適量單菌落于磁珠凍存管凍存。

1.3.2 生化試驗

取普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的疑似菌落接種于微量生化反應管，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄試驗結果。

1.3.3 血清學鑒定

這時的常愛蘭什么也聽不進去，但打孩子的動作總算是停了，馱子么在一邊不停地嘆著氣，唉，真丟人真丟人。他拿過一張又一張桌上的紙，直看得面紅耳赤，這種面紅耳赤就跟老樟樹下周大毛他們取笑他時一模一樣。

將分離菌株培養(yǎng)物用2 mL 0.5%石炭酸生理鹽水沖洗制成菌懸液，121 ℃高壓1 h破壞抗原。將高壓抗原與單因子血清做平板凝集試驗，觀察結果。

1.3.4 分子生物學檢測

按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取分離菌的基因組DNA作為后續(xù)PCR反應模板，使用16S rRNA通用引物擴增，目的片段為1 450 bp。PCR 反應體系見表1。PCR 擴增程序：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。電泳，使用膠收試劑盒回收目的條帶測序，利用NCBI數(shù)據庫比對結果并分析。

表1 PCR反應體系Tab.1 PCR reaction system

1.3.5 致病性試驗

1.3.5.1 菌液的制備

將分離株于肉湯培養(yǎng)基復蘇。用無菌PBS 溶液洗滌3次后，每管加入500 μL無菌PBS溶液制成菌懸液備用。

1.3.5.2 小鼠致病性試驗

表2 小鼠分組及處理方法Tab.2 Group and treatment methods of mice

1.3.6 藥敏試驗

參考《2019 年動物源細菌耐藥性監(jiān)測計劃》附件6，選取14 種抗生素進行試驗。根據美國臨床和實驗室標準（CLSI）的標準，采用微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗，觀察并記錄結果。

2 結果與分析

2.1 菌株分離培養(yǎng)結果（見圖1～圖4）

8份病料樣品，均有菌落生長。由圖1～圖4可知，分離株在普通瓊脂培養(yǎng)基為圓潤半透明灰白色菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上為邊緣整齊的中等大小濕潤粉紅色菌落；在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基形成黑色或黑紫色有明顯金屬光澤中等大小菌落。經革蘭氏染色鏡檢可見，G-，單個存在短小桿菌。以上特征符合大腸桿菌形態(tài)特征。

圖1 普通瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)結果Fig.1 Training result of common agar medium

2.2 菌株生化試驗結果（見表3）

由表3可知，選取8株分離株進行生化鑒定，結果與大腸桿菌生化特點相符。

2.3 菌株血清學鑒定結果

對分離菌株進行血清型鑒定，其中O883 株、O1712 株、O592株、O271株。

圖2 麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)結果Fig.2 Training result of McConkey medium

圖3 伊紅美藍培養(yǎng)基培養(yǎng)結果Fig.3 Training result of eosin methylene blue medium

圖4 大腸桿菌革蘭氏染色特征Fig.4 Gram staining characteristics of Escherichia coli

表3 菌株生化試驗結果Tab.3 Biochemical test results of strain

2.4 菌株分子生物學鑒定結果（見圖5）

由圖5可知，經PCR擴增及凝膠電泳，得到1 450 bp目的條帶，序列經NCBI 中Blast 在線比對，與大腸桿菌的同源性高于99%，確定其為大腸桿菌。

2.5 小鼠致病性試驗結果（見表4、圖6～圖8）

由表4可知，各血清型選取1株代表菌株，進行小鼠致病性試驗，4 組感染組小鼠發(fā)病率為92.5%，死亡率為87.5%，細菌學檢查陽性率均為100%。

由圖6、圖7可知，發(fā)病小鼠精神沉郁、腹部膨脹、口鼻發(fā)紺。由圖8可知，剖檢可見腹腔有纖維素滲出、肝臟腫大有瘀血斑、表面附著纖維素偽膜、脾臟暗紅腫大、心外膜出血、腎臟腫大有出血點。

2.6 藥敏試驗結果（見表5）

各血清型選取1株代表菌株，進行14種藥物敏感性試驗。由表5 可知，本次選取的4 株致病性大腸桿菌對甲氧芐啶、磺胺異惡唑敏感，對黏桿菌素、美羅塔南、氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢他啶、頭孢噻呋、氟苯尼考、四環(huán)素、大觀霉素、慶大霉素、氨芐西林耐藥。

圖5 16S rRNA PCR鑒定結果Fig.5 16S rRNA PCR results

圖6 發(fā)病小鼠精神沉郁、口鼻發(fā)紺Fig.6 Depression and cyanosis of mouth and nose in mice

圖7 病死小鼠腹部膨脹Fig.7 Abdominal distention in dead mice

表4 小鼠致病性試驗結果Tab.4 Results of pathogenicity test in mice

圖8 小鼠剖檢變化Fig.8 The changes of mice autopsy

3 討論

鵝大腸桿菌病病型復雜多變，常見有死胚、敗血癥、卵黃性腹膜炎、腦膜炎等[3]。本研究對遼寧省黑山縣某大型發(fā)病鵝場進行病例觀察和病原菌分離鑒定，確認為鵝大腸桿菌病。雛鵝主要表現(xiàn)為漿液纖維素性漿膜炎，成年鵝為卵黃性腹膜炎。此前，東北地區(qū)已有多個鵝場出現(xiàn)鵝致病性大腸桿菌感染發(fā)病，證明本病發(fā)生普遍、危害嚴重[4-7]。

大腸桿菌血清型眾多且不同血清型間交叉保護力低，所以需對當?shù)貎?yōu)勢血清型進行檢測，并結合相應血清型疫苗預防才能達到理想效果[8]。趙陽[9]于黑龍江省分離的鵝致病性大腸桿菌血清型為：O9、O18、O64、O93。本研究分離的黑山地區(qū)鵝致病性大腸桿菌血清型為：O88、O171、O59、O27，證明不同地區(qū)大腸桿菌血清型具有差異。小鼠致病性試驗證明：O171致病性最強，死亡率高達100%，其他血清型也具有較強致病性。

表5 藥敏試驗結果Tab.5 Results of drug sensitivity

2017 年，王春蓮等[10]關于承德地區(qū)鵝致病性大腸桿菌的研究中，分離株對四環(huán)素、復方新諾明的耐藥率也高達100%。本研究中的藥敏試驗結果表明，黑山地區(qū)分離株對黏桿菌素、美羅塔南等11 種抗生素嚴重耐藥。各地區(qū)鵝致病性大腸桿菌已產生較強耐藥性且有地區(qū)差異[11-13]。因此，科學應用敏感藥物對鵝大腸桿菌病進行防治才能達到理想效果。

4 結論

從遼寧省黑山縣某發(fā)病鵝場分離鑒定4 種血清型大腸桿菌，分別為O88、O171、O59、O27。所分離的鵝大腸桿菌是有較強致病性和耐藥性，建議選取敏感藥物甲氧芐啶、磺胺異惡唑對鵝大腸桿菌病進行防治或開發(fā)相應血清型疫苗進行免疫防控。