雞源大腸桿菌臨床株的分離鑒定及藥敏試驗

鄒導夫，吉藝寬，李美娣

（梅州職業技術學院，廣東梅州 514011）

大腸桿菌（Escherichia coli）學名大腸埃希氏菌，在養雞業中長期存在，各種日齡的雞均可感染，其中2～4周齡雛雞易感性最高，發病時表現為急性敗血癥狀，病死率較高[1-2]。由于耐藥菌株的出現，大腸桿菌病已成為養雞業中的重要挑戰[3]，其治療過程中難以針對性用藥，增加用藥成本，造成不必要的經濟損失。

大腸桿菌的血清型較多[4-5]，目前無法用疫苗進行預防控制，發病后通常使用抗生素進行治療。由于長期使用抗生素，大腸桿菌耐藥性普遍且耐藥譜不斷擴大[6-7]，導致有效治療藥物日漸減少，增加治療的難度。本研究通過對廣東某養雞場疑似大腸桿菌致死雞進行細菌分離鑒定，并進行藥敏試驗，為該場大腸桿菌病的綜合防控提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 病料采集

廣東博羅地區某養雞場在30 日齡前后爆發細菌性疾病，出現腹瀉癥狀，每日死亡率約1%。剖檢死雞可見包心、包肝等現象，使用多種抗生素均無效。采集30日齡病死雞肝臟。

梅州地區某養雞場40日齡開始出現輕微的拉稀癥狀。經剖檢未見包心、包肝等現象，未用抗生素，采集40日齡病死雞肝臟。

1.2 試驗試劑

麥康凱瓊脂培養基、MH 瓊脂培養基、LB 肉湯培養基均購自廣東環凱微生物科技有限公司；藥敏片紅霉素（15 μg/片）、青霉素（10 u/片）、氨芐西林（10 μg/片）、頭孢唑林（30 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、諾氟沙星（10 μg/片）、環丙沙 星（5 μg/片）、復 方 新 諾 明（23.75 μg/片）、氯 霉 素（30 μg/片）、丁胺卡那霉素（30 μg/片）購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 儀器設備

SW-CJ-2F超凈工作臺（蘇州真田潔凈設備有限公司）、SYQ-DSX-280A高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）、THZ-92B恒溫震蕩搖床（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、CX21 雙目顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]、HPX-9272MBE恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司）、101-3鼓風干燥箱（上海蘇進儀器設備廠）、TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）、Life Express PCR擴增儀（杭州博日基因擴增儀）、DYY-6C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.4 大腸桿菌的分離純化

1.4.1 分離培養

新鮮肝臟在火焰上消毒，用無菌接種針插入肝臟，劃線接種于麥康凱瓊脂培養基中，于（36±1）℃培養18～24 h，根據大腸桿菌在麥康凱上的生長特性，挑取單個粉紅色可疑單菌落繼續劃線于麥康凱瓊脂培養基中純化培養。

1.4.2 革蘭氏染色鏡檢

將疑似菌株進行革蘭氏染色鏡檢，于顯微鏡下觀察細菌的形態。

1.5 分子生物學鑒定

1.5.1 引物設計與合成

參考毛福超等[8]設計大腸桿菌特異性擴增引物進行合成，其上游引物序列為：EC370-F：5'-GATAAG CCCGCAGTCACCT-3'，下游引物序列為：EC370-R：5'-TCCCGTAACTCATCACCATCA-3'，預計擴增片段大小為370 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5.2 可疑菌株DNA提取

挑取經鏡檢的可疑菌落，接種于LB 肉湯中，于（36±1）℃震蕩培養18～24 h得出新鮮菌體培養物，以大腸桿菌44102 株做陽性對照，無菌水作陰性對照，進行DNA提取。提取步驟：吸取1 mL菌液于1.5 mL無菌離心管中，以12 000 r/min 離心1 min，棄去上清液，用無菌去離子水反復洗滌2 次，后100 μL 無菌水重懸，置于沸水浴中煮沸20 min，于12 000 r/min離心1 min，取上清液做DNA模板。

1.5.3 PCR擴增和凝膠電泳

參照TaKaRa Premix Taq Version 2.0 使用說明書，將Premix Taq 12.5 μL、DNA 模板1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、無菌蒸餾水9.5 μL準確量取加入PCR管中，吹打混勻。各組分充分混勻后，設置PCR擴增反應為：95 ℃預變性5 min、95 ℃變性30 s、61 ℃復性30 s、72 ℃延伸55 s 和72 ℃后延伸10 min，其中95 ℃變性、61 ℃復性和72 ℃延伸設定30個循環。取樣品10 μL立刻進行瓊脂糖凝膠電泳（電壓150 V，電泳時間25 min），在凝膠成像系統讀取結果，測序。

1.6 藥敏試驗

參照常規K-B 藥敏紙片擴散法對分離的菌株進行紅霉素、青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、諾氟沙星、環丙沙星、復方新諾明、氯霉素、慶大霉素和丁胺卡那霉素的藥敏試驗。取大腸桿菌新鮮培養肉湯，調整菌液濃度為1.0×106CFU/mL，用移液槍吸取100 μL 加入LB 瓊脂平板，采用無菌玻璃棒涂布均勻，放置5～10 min，待平板水分被完全吸收后，使用鑷子取藥敏紙片，貼于平板表面，輕輕按壓使其貼平，重復2 個平行，置于37 ℃培養18～24 h，觀察結果，使用游標卡尺測量抑菌圈大小，并做好記錄。結果判斷參照SN/T 1944—2016《動物及其制品中細菌耐藥性的測定——紙片擴散法》[9]。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離培養及鏡檢結果（見圖1、圖2）

圖1 麥康凱培養基培養結果Fig.1 Culture results of strains on McConnell medium

由圖1可知，分離菌株在麥康凱培養基上呈淺紅色、菌落中心顯桃紅色、圓形濕潤、表面光滑、邊緣整齊、菌落周圍麥康凱培養基變成粉紅色。

圖2 革蘭氏染色鏡檢結果Fig.2 Microscopic examination results of Gram stain

由圖2可知，革蘭氏染色后，在顯微鏡下可見菌株為革蘭氏陰性菌，呈紅色短桿菌，中等大小、兩頭鈍圓，未見莢膜和芽孢，初步分離得到2 株大腸桿菌分離株，并命名為ECGD2010-1和ECGD2010-2株。

2.2 PCR擴增鑒定結果（見圖3）

由圖3可知，從平板挑取菌落接入肉湯培養基中，經提取菌株DNA作為模板，用大腸桿菌引物進行PCR擴增，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析后，與DL5000 DNA Marker 和DL2000 DNA Maker 做比較，發現擴增片段在400～500 bp 之內，與陽性對照所處位置一致，和預期目的片段長度相符，條帶單一光亮。經測序后比對結果，顯示所分離菌株序列與大腸桿菌的同源性分別為99.0%和98.9%。

2.3 藥敏試驗結果（見圖4）

由圖4 可知，ECGD2010-1 菌株對紅霉素、青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、諾氟沙星、環丙沙星、復方新諾明、氯霉素表現為耐藥，僅對慶大霉素和丁胺卡那霉素表現為敏感；ECGD2010-2 菌株僅對氨芐西林表現為耐藥，對青霉素、諾氟沙星、紅霉素、頭孢唑林、慶大霉素、環丙沙星、復方新諾明、氯霉素、丁胺卡那霉素均表現為敏感。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis

圖4 藥敏試驗結果Fig.4 Drug sensitivity test results of strain

3 討論

廣東省是養禽大省。每年由于大腸桿菌感染導致的經濟損失巨大，其中主要是因為大腸桿菌的血清型較多。目前尚未有商品化疫苗上市，無法對其進行預防控制，發病后通常使用抗生素進行治療。長期大量使用抗生素引起細菌耐藥性[10]，且耐藥譜不斷擴大[6-7]，導致有效治療藥物日漸減少，從而增加治療的難度和成本。因此，對大腸桿菌臨床流行病學檢查及耐藥性監測是大腸桿菌病綜合防控的關鍵手段之一。此外，在用藥方面，需要通過交叉用藥、聯合用藥等方式，避免耐藥性產生，從而達到綜合防控的目的。

本試驗結果顯示，分離自廣東博羅地區某雞場的大腸桿菌菌株對青霉素等均表現為耐藥，僅僅對慶大霉素和丁胺卡那霉素敏感，藥敏試驗結果與主訴結果基本相同。分離自廣東梅州地區某雞場的大腸桿菌菌株僅對氨芐西林表現耐藥，而對其他抗生素均表現為敏感。經分離鑒定，在麥康凱瓊脂培養基上可見粉紅色或者淺粉色圓形菌落，表面光滑，直徑1～3 mm，符合大腸桿菌在麥康凱瓊脂培養基上的菌落特征。進一步做革蘭氏染色鏡檢鑒定，結果顯示為革蘭氏陰性菌，呈紅色短桿菌，符合大腸桿菌的革蘭氏染色特征。經PCR 擴增測序后，擴增出的片段長度在250～500 bp 之間的單一條帶，序列在NCBI 基因庫上經過同源性比對顯示ECGD2010-1 和ECGD2010-2 與大腸桿菌的同源性為99.0%和98.9%，確定所分離出的菌株均為雞源性大腸桿菌。

4 結論

本試驗結果表明，分離自廣東博羅地區某養雞場和梅州地區某養雞場的菌株為雞源大腸桿菌，命名為ECGD2010-1 株 和ECGD2010-2 株。ECGD2010-1 對 慶大霉素和丁胺卡那霉素敏感；ECGD2010-2株除對氨芐西林耐藥外，對其他抗生素均表現出高度敏感。