貴德黑裘皮羊mtDNA COI 基因系統進化分析

黃麗芬，韋落落，田思思，段云波，喬自林，李 鈾，2*

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730100；

2.西北民族大學生物醫學研究中心甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅蘭州 730030；3.西北民族大學生物醫學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅蘭州 730030）

貴德黑裘皮羊是我國青藏高原地區藏羊的特殊經濟類型，主要分布在我國青海省貴南縣，以產黑紫羔二毛皮而聞名[1]。貴德黑裘皮羊所產出的羔皮皮板堅韌、輕軟、毛色烏黑發亮、毛質細膩、毛辮不易黏結、毛卷花緊實美觀，呈環狀或半環彎曲狀，是我國裘用羊羔皮中的珍品[2]。在20 世紀80 年代中期，引進其他品種的羊與貴德黑裘皮羊進行雜交，導致品種優質資源純度下降，羔羊皮的品質也隨之下降。種質資源的下降曾一度讓貴德黑裘皮羊面臨絕種的危險[3]。因此，農業農村部多次將貴德黑裘皮羊確定為國家級遺傳資源保護品種，2014 年頒布的《中國國家級畜禽遺傳資源保護名錄》確定159 個畜禽品種為國家級畜禽遺傳資源保護品種，貴德黑裘皮羊名列其中[4]。因此，對貴德黑裘皮羊進行群體系統發育的分析，對今后開展貴德黑裘皮羊遺傳育種及資源保護和合理利用工作具有重要意義。

線粒體DNA（mtDNA）是動物細胞唯一一種核外遺傳物質，與核內DNA相比，分子量較小、進化速度較快、不與組蛋白結合而裸露并具有嚴格的母系遺傳、突變率高等特點。線粒體的這些特點對于研究動物遺傳關系及起源進化十分有利[5]。很多研究者對貴德黑裘皮羊進行分子方面的研究[6-8]。其中，基于線粒體DNA的研究數量較少，且主要以線粒體D-loop 區和Cytb 基因為擴增對象，其他線粒體基因在貴德黑裘皮羊系統進化方面的研究應用較少[6,9]。近年來，研究發現羊線粒體DNA 的COI 基因含有的遺傳物質具有很強的系統解析能力，主要用于屬、種級系統發育的研究[10]。但還未有學者利用此基因對貴德黑裘皮羊進行系統發育分析。本研究基于線粒體COI 基因對貴德黑裘皮羊進行系統發育分析，并探討其與其他品種綿羊的遺傳關系，為后續貴德黑裘皮羊的保種工作及資源合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究中使用的貴德黑裘皮羊樣本來自西北民族大學生物醫學研究中心的動物細胞保藏庫，共選取樣本5支，樣本信息見表1。

表1 樣本信息Tab.1 Sample information

1.2 基因組DNA的提取及DNA濃度檢測

使用常規方法將凍存細胞進行復蘇培養后，采用通用型基因組DNA 提取試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）對細胞進行基因組DNA的提取，使用Qubit 4對所提取的基因組DNA進行濃度檢查。

1.3 引物與PCR擴增

以Genbank中綿羊mtDNA（序列號為AF010406）全序列為基礎，進行引物的設計。所設計的上游引物為COIF（5'-ACAGTCGGAATAGACGTCGA-3'），下 游 引 物 為COIR（5'-GGTTCTTCAAATGTGTGGTATGG-3'）。引物由寶生物工程（大連）公司合成。利用所設計的引物對貴德黑裘皮羊進行線粒體COI基因序列的擴增。試驗前，通過不斷的試驗，建立最佳的PCR 擴增體系，此次擴增體系（25 μL）：上下游引物為0.5 μL 和10 μmol/L、DNA 2 μL、2×Pro Taq Master Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環35 次；最后72 ℃延伸10 min。將擴增產物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳，在136 V 電壓下跑膠30 min 進行檢測。檢測合格的擴增產物送蘭州天啟基因生物科技有限公司測序。

1.4 數據統計與分析

獲得測序結果用Geneious 11.0.4 處理原始測序文件，將2 條序列的波峰進行拼接得到比較完整序列的波峰圖，并對完整的樣本序列波峰圖進行校對，最終生成Fasta 文件格式獲得單個樣本的完整序列。所得貴德黑裘皮羊COI 基因序列與Genbank 上已發表的其他綿羊品種的COI 基因序列用MEGA-X 處理，所用綿羊品種信息見表2。

表2 Genbank上已發表的綿羊品種信息Tab.2 Sheep breed information published on the Genbank

計算貴德黑裘皮羊種內及貴德黑裘皮羊與其他綿羊品種間的遺傳距離，構建ML進化樹、NJ進化樹，并進行系統發育分析。選用p-disdtance作為模型構建NJ進化樹進行遺傳距離的計算。運用MEGA軟件中的MODELS功能對構建ML 進化樹的最佳模型進行計算。通過計算，查看序列數據的BIC值（BIC值表示的是模型對數據的解釋度，BIC值越小則表示模型對數據的解釋力越強），并選取BIC值最低的模型作為最佳模型進行ML樹的構建。

2 結果與分析

2.1 COI基因擴增測序結果

將檢測合格的PCR 擴增產物送由蘭州天啟基因生物科技有限公司進行測序，測序結果顯示擴增序列長度合適，為所擴增目標基因序列，經過序列拼接校對后得到的序列長度均為622 bp，整理后的結果僅發現GD-3 樣本在622 bp處發生單核苷酸變異，堿基A突變為堿基T，其他樣本序列均未發生突變。

2.2 貴德黑裘皮羊基于COI基因系統發育分析

利用MEGA將經Geneious11.0.4軟件拼接校對后的貴德黑裘皮羊COI序列與在GenBank上下載的52個序列，用鄰近法（見圖1）和最大似然法（見圖2）進行貴德黑裘皮羊系統發生樹的構建。

圖1 NJ系統發生樹Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree

圖2 ML系統發生樹Fig.2 Maximum Likelihood phylogenetic tree

由圖1 可知，基于COI 基因用鄰近法所構建的系統發生樹可看出貴德黑裘皮羊品種之間，樣本GD-1、GD-4、GD-5距離較近，樣本GD-2和GD-3與其他3個樣本距離較遠，但都聚在同一支上。同時，試驗選用的5個貴德黑裘皮羊樣本個體COI 基因序列與烏珠穆沁羊、灘羊、青海藏羊、塔什庫爾干羊等18個品種的羊聚為一支，說明所試驗貴德黑裘皮羊與這18個綿羊品種有較近的親緣關系；也說明所采集到的貴德黑裘皮羊樣本有可能與這18個親緣關系較近的品種的羊存在基因流。結果顯示，貴德黑裘皮羊與蒙古盤羊、西藏盤羊、芬蘭綿羊等34個國際羊的品種沒有聚在同一支上，有較遠的親緣關系。其中，親緣關系最遠的是蒙古盤羊、西藏盤羊。

基于COI基因序列先運用MEGA軟件中MODELS功能計算，找到構建最大似然法系統發生樹的最佳模型Tamura 3-parameter，進而利用最大似然法所構建的系統發生樹。由圖2可知，結果與鄰近法所建的系統發生樹結果相差不大，顯示貴德黑裘皮羊樣本仍與烏珠穆沁羊、灘羊、青海藏羊等18 個國際上的綿羊品種聚為一支，樣本GD-2與樣本GD-1、GD-4、GD-5距離較近，樣本GD-3卻與其他4個樣本有一定差異，說明該樣本與其他綿羊品種存在基因流，可能是品種間雜交導致。

3 討論

mtDNA 在生物體內會隨著線粒體獨立復制，不受核基因影響，不與組蛋白結合而裸露，具有嚴格的母系遺傳特點，且拷貝數遠遠高于核DNA。核基因會隨著待檢樣本的變質腐蝕而降解，但樣本仍可通過PCR 擴增技術對mtDNA進行擴增檢測，且與核基因相比，mtDNA擴增更容易[11]。mtDNA 較核基因有較低的突變率，mtDNA 在一些區段變異較快，而基于母系遺傳的特點在另一區段可能相對保守。同時，母系遺傳的特點使其不受外來雜交公畜基因的影響，并且保留好進化過程中的變異位點，能夠在系統進化研究中更好地提供遺傳材料[12]。近年來，研究發現mtDNA 的COI 基因含有的遺傳物質具有很強的系統解析能力，適用于屬、種間的遺傳進化關系研究，有不少研究利用其進行物種遺傳進化的研究并取得一定成果。徐浩文等[13]經過對8個地理種群紅條毛膚石鱉COI基因進行擴增研究遺傳多樣性，得到南方與北方的紅條毛膚石鱉群體遺傳多樣性存在差異，應該對2個地區的紅條毛膚石鱉分別進行相對應的保護措施。趙慶等[14]利用COI 基因分析我國重要的貝類之間的系統進化關系，研究表明，COI 基因能對不同區域的同一種群進行聚類，驗證COI基因在物種系統進化研究中的可行性。但是，目前尚未見到對貴德黑裘皮羊進行COI基因擴增研究其系統進化關系的報道。

因此，本次試驗經過反復試驗，選取PCR 最優反應體系對貴德黑裘皮羊線粒體DNA的COI基因進行擴增。因核苷酸序列數據屬于性狀數據，不能夠通過核苷酸序列來研究物種的進化距離，所以得到的擴增結果經測序及Geneious11.0.4軟件校對處理后需要用軟件將核苷酸序列數據轉化為種群個體之間的距離值，再進行分析[15]。本試驗結果顯示，貴德黑裘皮羊樣本之間均聚為一支，但GD-3與其他樣本GD-1、GD-2、GD-4、GD-5 有一定的親緣距離。同時，在參與系統進化樹構建的GenBank 上下載的52 個品種羊中，與貴德黑裘皮羊聚為一支的共有18 個品種，與貴德黑裘皮羊有較近的親緣關系，可以初步判斷所采集貴德黑裘皮羊樣本有可能與國際上其他綿羊品種進行了雜交，且樣本GD-3 個體與其他親緣關系相對較遠品種的羊進行了雜交。其余34個國際上的綿羊品種都沒有與貴德黑裘皮羊品種聚為一支，與貴德黑裘皮羊有較遠的親緣關系，其中親緣關系較遠的是蒙古盤羊和西藏盤羊。

4 結論

本研究結果顯示，貴德黑裘皮羊種質資源的保護應避免其與其他綿羊品種之間的基因流。未來研究工作應利用多基因、多手段的分析方法，系統、全面地揭示貴德黑裘皮羊種群遺傳情況與系統進化關系，為其種質資源遺傳保護提供可靠的參考依據。