不同提取方法對(duì)金匱腎氣片中丹皮酚、黃芩苷含量的影響*

付恩桃，李會(huì)婷，湯 潔，鐘先錦，楊澤星，胥振國(guó)

(1 合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽 合肥 238000；2 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院，安徽 合肥 230036)

金匱腎氣片是用于治療腎虛水腫，腰膝酸軟，小便不利，畏寒肢冷等癥狀的中成藥，其組方中主要包括牡丹皮、山藥、桂枝等十味藥材[1-3]，主要臨床功效表現(xiàn)為化氣行水、溫補(bǔ)腎陽(yáng)。由于金匱腎氣片中的成分較復(fù)雜，因而對(duì)其質(zhì)量的控制存在一定的難度，目前該藥品執(zhí)行的是國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(WS-10439(ZD-0439)-2002-2011Z)，由于標(biāo)準(zhǔn)暫沒(méi)有更新，且標(biāo)準(zhǔn)中缺少對(duì)相關(guān)成分的準(zhǔn)確定量。考慮到藥品臨床應(yīng)用的安全性和有效性，迫切需要對(duì)藥品中的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行規(guī)范和提升。

丹皮酚是金匱腎氣片組方中牡丹皮的主要藥用成分，天然具有廣泛的生物活性，具體表現(xiàn)為解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)靜催眠等作用[4]；黃芩苷是組方中地黃等中藥材的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗過(guò)敏及抗癌等作用，已成為活性物質(zhì)研究的熱點(diǎn)之一。目前文獻(xiàn)對(duì)于金匱腎氣片的提取方法研究未作任何報(bào)道，不同的提取方法會(huì)對(duì)藥物中有效成分的含量產(chǎn)生一定的影響[5-6]，本文分別采用超聲法、回流提取法對(duì)金匱腎氣片進(jìn)行提取，并以丹皮酚和黃芩苷為指標(biāo)性成分，利用HPLC-PDA法準(zhǔn)確測(cè)定其含量，從而為快速、準(zhǔn)確、全面的控制金匱腎氣片的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀;2998 PDA檢測(cè)器;MS205DU十萬(wàn)分之一分析天平,梅特勒-托利多;KQ-300VDE超聲波清洗器,昆山舒美。實(shí)驗(yàn)中所用對(duì)照品：黃芩苷(批號(hào)21967-419，含量98.0%),大連美侖生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi);丹皮酚 (批號(hào)110708-201407，含量99.9%),中國(guó)食品藥品檢定研究院。水為純化水，甲醇為色譜純，磷酸為分析純，金匱腎氣片(批號(hào)1106734，0.27 g/片),廣東臺(tái)城制藥股份有限公司。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱選用大連依利特Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(46:54)[7]，測(cè)定波長(zhǎng)276 nm，進(jìn)樣體積20 μL，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將黃芩苷和丹皮酚對(duì)照品分別稀釋制成10 μg/mL和5 μg/mL的溶液，然后在200～400 nm波長(zhǎng)下分別進(jìn)行掃描，通過(guò)紫外掃面圖譜，可看出黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)顯示為280 nm，丹皮酚的最大吸收波長(zhǎng)顯示為274 nm，考慮本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定黃芩苷和丹皮酚兩種成分的含量，因此最終確定測(cè)定波長(zhǎng)為276 nm。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液

取對(duì)照品，精密稱定(丹皮酚10.40 mg、黃芩苷10.20 mg)，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解、稀釋定容至刻度，得對(duì)照品母液。精密吸取黃芩苷母液0.5 mL，丹皮酚母液1.0 mL置同一10 mL量瓶中，并用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，充分振搖均勻，即得。

2.3.2 供試品溶液

圖1 金匱腎氣片液相色譜圖Fig.1 Jingui Shenqi tablets liquid chromatogram

超聲法：取金匱腎氣片20片，除去薄膜衣，于研缽中充分研細(xì)，取細(xì)粉約1 g，精密稱定，放置于具塞錐形瓶中，精密加入100 mL濃度為50%的甲醇溶液，立即精密稱定其重量后，用功率為300 W超聲儀超聲，并分別考察回流20 min、40 min、60 min三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，然后取出樣品放冷，再精密稱定重量，損失的重量用50%的甲醇不足，充分搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。

回流法：取金匱腎氣片20片，除去薄膜衣，于研缽中充分研細(xì)，取細(xì)粉約1 g，精密稱定，放置于具塞錐形瓶中，精密加入100 mL濃度為50%的甲醇溶液，立即精密稱定其重量后,于水浴上回流提取，并分別考察了回流20 min、40 min、60 min三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，然后取出樣品放冷，再精密稱定重量，損失的重量用50%的甲醇不足，充分搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 線性關(guān)系考察

取上述丹皮酚和黃芩苷的混合對(duì)照品溶液，精密吸取0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用配制好的流動(dòng)相稀釋定容至刻度，充分振搖，即得混合對(duì)照品系列溶液；分別取上述系列溶液20 μL，按照確定的色譜測(cè)定方法，以丹皮酚和黃芩苷的濃度C(μg/mL)作為橫坐標(biāo)，測(cè)定出的各自峰面積A為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)進(jìn)行回歸得到線性方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察Table 1 Investigation of linear relationship

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

按照上述色譜條件，取丹皮酚和黃芩苷的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算得到丹皮酚和黃芩苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，分別為0.10%、0.62%，由此表明方法精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為(1106734)的金匱腎氣片，按照上述配制方法，平行制備供試品溶液6份，分別測(cè)定樣品中丹皮酚和黃芩苷的峰面積，計(jì)算含量，測(cè)得樣品中丹皮酚和黃芩苷的平均含量分別為0.760 mg/片、0.137 mg/片，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.85%、0.83%。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取上述同法配制的供試品溶液一份，依據(jù)上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定其在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h丹皮酚和黃芩苷的峰面積，并計(jì)算丹皮酚和黃芩苷峰面積的RSD分別為0.77%、0.48%，表明供試品溶液于配制好放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為(1106734)的金匱腎氣片樣品共9份，每份細(xì)粉重量約0.27 g，分為低、中、高三組，每組3份，然后分別加入上述配制的丹皮酚對(duì)照品母液0.6、0.7、0.8 mL，黃芩苷對(duì)照品母液0.1、0.2、0.3 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行分析測(cè)定，得到回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 2 Recovery test results (n=9)

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.6 樣品含量

取金匱腎氣片樣品3個(gè)批次，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照外標(biāo)法進(jìn)行定量，測(cè)得金貴腎氣片中丹皮酚和黃芩苷的含量見(jiàn)表3。由表3可知，超聲法與回流法組內(nèi)比較，提取20 min，藥物中丹皮酚和黃芩苷的提取含量均小于40 min(P<0.05)，提取60 min丹皮酚和黃芩苷的提取含量與40 min無(wú)明顯差異(P>0.05)；藥物中藥物的提取含量超聲法與回流法組間比較，提取20 min，60 min超聲法提取丹皮酚含量均小于回流法 (P<0.05)，提取20 min、40 mim、60 min超聲法提取黃芩苷含量均小于回流法(P<0.05)。

表3 金匱腎氣片中不同提取方法丹皮酚和黃芩苷的含量

3 討 論

3.1 流動(dòng)相選擇

通過(guò)文獻(xiàn)檢索和研讀發(fā)現(xiàn)，對(duì)于丹皮酚和黃芩苷兩個(gè)指標(biāo)性成分的相關(guān)定量研究，文獻(xiàn)中大多采用梯度洗脫方法，尤其是多指標(biāo)成分含量測(cè)定，然而由于分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，分析效率不高，不利于金匱腎氣片的常態(tài)化的質(zhì)量控制的需要。在此基礎(chǔ)上，本文先后考察了甲醇-水、乙腈-水等不同比例的流動(dòng)相體系，存在目標(biāo)成分分離不完全，風(fēng)峰不佳等問(wèn)題，經(jīng)過(guò)比較及優(yōu)化，確定以甲醇-0.1%磷酸水溶液(46:54)為流動(dòng)相，等度洗脫，色譜峰的峰形較好，色譜圖中雜質(zhì)對(duì)待測(cè)組分無(wú)干擾，完全分離，能夠滿足分析檢測(cè)的要求。

3.2 提取條件

本文分別采取了超聲法、回流法對(duì)金匱腎氣片進(jìn)行了提取，同時(shí)考察了20、40、60 min三個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，依據(jù)測(cè)定結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，若單一以丹皮酚作為指標(biāo)性成分來(lái)評(píng)價(jià)金匱腎氣片時(shí)，則優(yōu)選超聲40 min作為提取條件，提取操作簡(jiǎn)單；若單一以黃芩苷作為指標(biāo)性成分來(lái)評(píng)價(jià)金匱腎氣片時(shí)，則優(yōu)選回流40 min作為提取條件，黃芩苷的提取率較高；若同時(shí)以丹皮酚和黃芩苷作為指標(biāo)性成分來(lái)綜合評(píng)價(jià)金匱腎氣片時(shí)，則可考慮選用回流40 min作為提取條件，提取操作稍微復(fù)雜，但綜合提取率較高，更能全面反映藥品的質(zhì)量。

4 結(jié) 論

由于現(xiàn)行金匱腎氣片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)含量測(cè)定要求過(guò)于單一，然而對(duì)于中藥制劑來(lái)說(shuō)，單一指標(biāo)成分已難以控制藥品的質(zhì)量，因此本文考察了超聲和回流兩種不同提取方法，同時(shí)考察了提取時(shí)間對(duì)丹皮酚和黃芩苷兩種成分含量的影響[8-9]，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化形成了以甲醇-0.1%磷酸水為流動(dòng)相的洗脫方法，對(duì)進(jìn)一步全面有效的控制金匱腎氣片質(zhì)量提供參考。