民族藥鐵包金基于FGF2/FGFR1通路改善抑郁樣行為的機制研究※

●李成付 張秋萍 萬慧琪 許光輝 易立濤

抑郁癥是一種常見的精神性疾病，臨床表現主要是情緒低落，患者往往愁眉苦臉，感受情緒能力差，對身邊事物沒有興趣，從日常生活中體驗不到快樂。世界衛生組織指出目前抑郁癥影響全球1.2億人，已成為全球第二大負擔疾病。抑郁癥的發病率和復發率較高，治療藥物價格相對昂貴，對患者家庭和社會產生了相當沉重的經濟壓力。因此，迫切需要價格低廉，治療效果好的抗抑郁藥物。

鐵包金始載于《嶺南采藥錄》，并為《廣西中藥材標準（1990）》所收錄，該標準收錄的鐵包金是鼠李科勾兒茶屬植物細葉勾兒茶Berchemia lineata(L.)DC.的干燥根，主要分布于我國南部的廣西、福建、廣東、海南等省區。其性味淡、澀、平，具有固腎益氣、鎮咳消滯、止血止痛等多種功效，用于腫瘤、精神病、心臟病等多種疾病的治療。關于鐵包金的報道主要集中于對其化學成分的研究，而對其藥理活性的研究較少。張國利分離到槲皮素、異鼠李素、槲皮素-7-二甲醚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃素-鼠李糖苷、異喬木萜醇和β-谷甾醇[1]；沈玉霞則分離得到9個黃酮類化合物，4個蒽醌類化合物，4個木脂素類化合物和1個萜類化合物[2]；曾曉君分離得到數個甾醇類化合物和幾個黃酮衍生物[3]。藥理學研究資料則較少，僅發現鐵包金具有抗炎鎮痛、抗肝損傷和抗腫瘤等活性。因此，進一步拓展鐵包金的藥理活性，有助于進一步開發民族藥鐵包金的應用價值。本文首次通過行為學模型評價鐵包金的抗抑郁作用，并從成纖維細胞生長因子2（FGF2）/成纖維細胞生長因子受體1（FG?FR1）信號通路探索其抗抑郁作用機制。

1 材料

1.1 動物雄性ICR 小鼠，SPF 級，體重（26±2）g，10周齡，購自上海斯萊克動物中心，實驗動物許可證：SCXK（滬）2017-005。小鼠10只/籠，室溫（22±2）°C，光暗周期為12 h/12 h（光照時間07：00—19：00），自由獲得飼料與飲水，適應環境1周后開始實驗。

1.2 藥物及試劑鹽酸氟西汀（購自常州四藥制藥有限公司）用磷酸鹽緩沖液（pH7.4）溶解；LPS（美國Sigma-Aldrich 公司）用磷酸鹽緩沖液（pH7.4）溶解。FGF2抗體購買自美國Santa Cruz 公司。磷酸化FGFR1抗體、FGFR1抗體購買自美國Abcam公司。

1.3 鐵包金粉末制備鐵包金2018年采集于廣西，經廈門市中醫院陳雪梅主任藥師鑒定為鼠李科勾兒茶屬植物細葉勾兒茶Berchemia lineata(L.)DC.的干燥根。采用液氮低溫粉碎鐵包金之后，用0.5%的CMCNa制備混懸液。

2 方法

2.1 急性給藥實驗雄性ICR小鼠150只，適應性喂養1周后，將小鼠隨機分為三批。每批分為以下5組（n=10）：模型對照組（生理鹽水），鐵包金低劑量組（2 g/kg），鐵包金中劑量組（4 g/kg），鐵包金高劑量組（8 g/kg），陽性對照氟西汀組（20 mg/kg）。按以上分組灌胃給藥，給藥1小時后，分別進行強迫游泳實驗、懸尾實驗和開場實驗。

2.1.1 強迫游泳實驗 在（25±2）℃下，將小鼠放置在充滿40 cm 水的透明玻璃容器（高20 cm，直徑14 cm）中游泳。除了小鼠試圖使頭部保持在水面之上所必需的動作以外，小鼠沒有試圖逃脫的時間被記錄為不動時間。實驗持續6 min，統計最后4 min 內的不動時間。

2.1.2 懸尾實驗 將小鼠尾巴距尾尖約1 cm 處懸掛在長、寬和高分別是25 cm、25 cm和30 cm的裝置中，頭部朝下懸掛，距離底部約5 cm，總記錄時間為6 min，統計小鼠后4 min 內總不動時間，即小鼠完全沒有掙扎的狀態。

2.1.3 開場實驗 將小鼠置入一個長寬均為40 cm、高為30 cm 的白色曠場內，底板也為白色，且其底部劃分為25塊相等的正方形（8×8 cm），每次將小鼠放在正中央格子后開始計時，每次計時3 min，監測指標為小鼠跨格次數及僅后肢站立的直立次數。

2.2 LPS 實驗雄性ICR 小鼠60只，適應性喂養1周后，將小鼠隨機分為以下6組（n=10）：正常對照組（生理鹽水），模型對照組（生理鹽水），鐵包金低劑量組（2 g/kg），鐵包金中劑量組（4 g/kg），鐵包金高劑量組（8 g/kg），氟西汀組（20 mg/kg）。按以上分組持續灌胃給藥7天，最后1次給藥1 h 后，除正常對照組外，其余組的小鼠腹腔注射0.83 mg/kg LPS[4]，進行糖水偏好實驗及強迫游泳實驗，之后處死動物取大腦海馬組織。

2.2.1 糖水偏好實驗 按照之前的文獻[5]進行適當的更改。在測試之前，對小鼠進行糖水訓練。將兩瓶1%蔗糖溶液在每個籠子上放置24 h，然后用一瓶純水代替一瓶1%蔗糖溶液24 h，期間，12 h 時對水瓶更換一次位置。適應后，剝奪水食12個h，之后開始正式實驗。在測試過程中，將小鼠置于單獨的籠子中，小鼠可以分別在兩個瓶子中自由飲用1%蔗糖溶液和水。在實驗開始12 h后，將1%蔗糖溶液和水互換位置。24 h 后，記錄消耗的蔗糖溶液和水的重量，并計算糖水偏好值。

2.2.2 強迫游泳實驗 同2.1.1。

2.2.3 組織提取 強迫游泳實驗后，摘小鼠眼球快速放光血液。然后斷頭處死小鼠，快速取出海馬，立即用液氮凍結。組織樣本在-80 ℃下貯存至分析完成。

采用RIPA 裂解液對海馬組織進行勻漿，隨后于層析柜振蕩器中振蕩15 min，之后將勻漿液以12000 r/min 的速率離心5 min，取上清液測定蛋白濃度。蛋白溶液在加入上樣緩沖液后，進行SDS-PAGE電泳并轉膜。5%小牛血清蛋白封閉1 h 后，加入相應抗體（1：1000）孵育過夜，之后加入連接HRP的二抗并孵育1 h。最后采用ECL顯影液于化學發光成像儀中曝光成像。

2.3 數據分析所有的數據用平均值±標準差()表示，用SPSS 16.0軟件進行數據分析。統計差異用單因素方差分析結合Tukey檢驗。P＜0.05代表差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 急性給藥實驗

3.1.1 鐵包金對小鼠游泳不動時間的影響 給藥1 h 后，低、中、高劑量的鐵包金均能顯著降低小鼠的游泳不動時間（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01），同時陽性藥氟西汀也可顯著降低小鼠的游泳不動時間（P＜0.05）。見表1。

表1 鐵包金對小鼠強迫游泳實驗中不動時間的影響（n=10，）

表1 鐵包金對小鼠強迫游泳實驗中不動時間的影響（n=10，）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.1.2 鐵包金對小鼠懸尾不動時間的影響 給藥1 h 后，低、中、高劑量的鐵包金均能顯著降低小鼠的懸尾不動時間（P＜0.05或P＜0.01），同時陽性藥氟西汀也可顯著降低小鼠的懸尾不動時間（P＜0.01）。見表2。

表2 鐵包金對小鼠懸尾實驗中不動時間的影響（n=10，）

表2 鐵包金對小鼠懸尾實驗中不動時間的影響（n=10，）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.1.3 鐵包金對自發活動的影響 給藥1 h 后，低、中、高劑量鐵包金及氟西汀對小鼠跨格次數和直立次數均沒有顯著性影響。見表3。

表3 鐵包金對小鼠開場實驗中自發活動的影響（n=10，）

表3 鐵包金對小鼠開場實驗中自發活動的影響（n=10，）

3.2 LPS實驗

3.2.1 鐵包金對LPS 小鼠糖水偏好值的影響 與正常對照組相比，模型對照組小鼠糖水偏好值顯著降低（P＜0.01）。低、中、高劑量鐵包金均可顯著增加小鼠糖水偏好值（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。同時，陽性對照氟西汀組也可增加小鼠糖水偏好值（P＜0.01）。見表4。

3.2.2 鐵包金對LPS小鼠游泳不動時間的影響 與正常對照組相比，模型對照組小鼠不動時間顯著增加（P＜0.01）。中、高劑量鐵包金可顯著降低小鼠不動時間（P＜0.05）。同時，陽性對照氟西汀組也可降低小鼠不動時間（P＜0.05）。見表5。

表4 鐵包金對LPS小鼠糖水偏好值的影響（n=10，）

表4 鐵包金對LPS小鼠糖水偏好值的影響（n=10，）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表5 鐵包金對LPS小鼠游泳不動時間的影響（n=10，）

表5 鐵包金對LPS小鼠游泳不動時間的影響（n=10，）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05

3.2.3 鐵包金對小鼠海馬FGF2及FGFR1表達水平的影響 與正常對照組相比，模型對照組小鼠FGF2及磷酸化FGFR1水平顯著降低（P＜0.05）。中、高劑量鐵包金可顯著增加LPS 小鼠海馬FGF2表達水平（P＜0.05，P＜0.01）。低、中、高劑量鐵包金均可顯著增加LPS 小鼠海馬FGFR1磷酸化水平（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。同時，氟西汀也可以增加FGF2及磷酸化FG?FR1水平（P＜0.01，P＜0.01）。見圖1。

4 討論

中醫認為肝主疏泄，性喜條達，情緒郁悶及情緒暴怒等精神刺激，均可使肝失疏泄，氣機不暢，以致憂思郁怒，肝氣郁結，因此中醫主要是從消郁結著手治療抑郁癥。《廣西中藥材標準》記載民族藥鐵包金具有鎮咳消滯的功效，此功效正契合郁證“氣機郁滯”之病機，因此本文首次對鐵包金是否具有抗抑郁作用展開了研究。

本實驗首先采用強迫游泳實驗和懸尾實驗來觀察鐵包金是否具有改善小鼠絕望狀態的作用。結果發現，鐵包金顯著降低了小鼠游泳和懸尾不動時間。與此同時，在開場實驗中，鐵包金對小鼠自發活動行為沒有影響，表明鐵包金降低不動時間的作用與神經興奮性沒有關系，即鐵包金具有抗抑郁作用。隨后，本實驗采用LPS 誘導的抑郁模型再次評價了鐵包金的抗抑郁作用。LPS誘導的炎癥抑郁模型廣泛地被用于與炎癥相關的機制研究[6]。結果表明，LPS 顯著降低了小鼠的糖水偏好值和增加了小鼠的游泳不動時間，表明LPS誘導了小鼠的快感缺失和絕望等抑郁行為，鐵包金給藥之后，顯著增加了糖水偏好值和降低了不動時間，表明鐵包金具有較好的抗抑郁作用。

圖1 鐵包金對LPS小鼠FGF2及FGFR1表達水平的影響（n=5）

FGF是一類生長因子蛋白質家族，包含多個結構相似的多肽。在成年大腦中，FGF2主要在腦室下區和齒狀回高度表達，高濃度的FGF2可以促進神經細胞增殖以及促進多能神經干細胞分化，維持成年小鼠的神經發生[7]。因此激活FGF2信號通路對中樞神經系統疾病具有潛在的治療作用[8]。同時有報道指出，神經炎癥下調了FGF2-ERK1/2信號通路。外源FGF2可以防止神經炎癥引起的ERK1/2磷酸化減少，減輕海馬神經發生中神經炎癥引起的損傷，從而緩解了神經炎癥誘導的抑郁樣行為[9-10]。本實驗中，LPS模型組小鼠海馬FGF2含量明顯低于正常組，說明LPS 抑制了小鼠海馬FGF2的表達。給予中劑量和高劑量鐵包金之后，可增加海馬FGF2的表達；與之相對應的是，LPS 模型組小鼠海馬FGFR1磷酸化程度明顯低于正常組，說明LPS抑制了小鼠海馬FGFR1的磷酸化。給予鐵包金之后，均可增加海馬FGFR1的磷酸化。以上結果說明鐵包金可以激活海馬FGF2/FGFR1信號通路，從而產生抗抑郁作用。

綜上所述，鐵包金單次及多次給藥均可緩解絕望及快感缺失等抑郁癥狀，能夠逆轉LPS誘導的小鼠抑郁樣行為。同時本實驗探討了鐵包金的抗抑郁作用機制與FGF2/FGFR1信號通路的活化相關，但是實驗沒有對鐵包金有效成分進行分離，未對FGF2/FGFR1下游信號蛋白進行檢測，也沒有對鐵包金如何通過FGF2/FGFR1通路調節小膠質細胞和神經炎癥進行深入研究。后續對這些問題的進一步探索將會在抗抑郁的新藥開發中產生重要的意義。