基于網絡藥理學探討溫膽湯治療高血壓的作用機制

●李人亮 胡子毅 張 平

高血壓是一種以體循環動脈壓力升高為主要特征的心血管綜合征，是臨床常見的慢性疾病，是心腦血管疾病最常見但可逆的危險因素之一。大多數高血壓患者沒有明顯的癥狀，少數可出現頭暈、頭痛和其它輕微癥狀，正是由于高血壓病缺乏典型的癥狀，使得其在人群中具有潛伏性，難以及時發現[1]。長期的高血壓可致使動脈粥樣硬化，而動脈粥樣硬化也會促使血壓進一步升高，兩者互相關聯、相互促進，最終導致心、腦、腎等重要靶器官功能障礙，其常見的合并癥有冠心病、腦卒中、急性主動脈綜合征、外周動脈疾病[2]。根據2010年全球疾病負擔研究，中國每年由于血壓升高而導致的過早死亡人數高達200萬，每年直接醫療費用達366億元人民幣[3]。根據2010年第六次全國人口普查數據測算，我國高血壓患病人數約為2.45億[4]。高血壓對我國造成了巨大的社會經濟壓力和公共衛生負擔，因此積極防治高血壓具有重大意義。隨著現代醫學的飛速發展，盡管在血壓的控制方面取得了顯著的進步，但在緩解癥狀、改善血管內皮功能、保護靶器官等方面，中醫藥治療更具優勢。

高血壓病在中醫學理論中歸屬于“眩暈”“頭痛”等范疇，本病以陰虛為本，陽亢為標，瘀血貫穿疾病始終，其中火、飲、虛是病機關鍵，三者往往合并存在，交互為病[5]。肝陽上亢，肝火上炎，陽升風動，上沖腦竅；脾胃虛弱，痰飲內生，肝風、肝陽夾痰濁之邪上沖清竅；大病久病及腎，腎陰虧虛，水不涵木，腦竅失養。武玉琳等人[6]對2001年至2017年已發表的關于中醫藥治療原發性高血壓的文獻進行收集整理，篩選出有效處方1042個，通過復雜網絡分析，得出了6個最為常見的中醫證型，即肝陽上亢證、陰虛陽亢證、痰濕壅盛證、肝腎陰虛證、陰陽兩虛證、肝火亢盛證。近年來的研究顯示痰濕證候在高血壓病中頗為常見[7]。溫膽湯出自《三因極一病證方論·驚悸證治》，其組成包括半夏、陳皮、竹茹、枳實、茯苓、甘草六味藥物，具有理氣化痰，利膽和胃之功，臨床常應用于治療痰濕壅盛、痰濁中阻型高血壓。有研究表明[8]，溫膽湯對心臟間質成纖維細胞的過度增殖有一定的抑制作用，對高血壓的心肌纖維化有預防與逆轉作用，但具體機制尚不清楚，因此本研究運用網絡藥理學方法，探尋溫膽湯治療高血壓的關鍵活性成分和主要靶點通路。

1 材料與方法

1.1 溫膽湯活性成分的獲取及靶點的篩選利用中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），以陳皮、半夏、茯苓、甘草、枳實、竹茹為關鍵詞，對溫膽湯中6味中藥的全部化學成分進行收集。若在TCMSP 數據庫中無法獲取數據，則通過TCMID 數據庫（http：//bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx）和化學專業數據庫（Chemsitry Database，http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp），以及檢索國內外相關文獻獲取相關信息。通過限制口服吸收利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL）≥0.18對溫膽湯的活性成分篩選[9]。然后將篩選好的候選活性成分在TCMSP 數據庫和SwissTarget Prediction 數據庫（http：//swisstargetprediction.ch/）中收集蛋白靶點。最后通過Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）進一步將收集到的蛋白靶點轉化為對應的基因名稱，獲取與活性成分作用的相關蛋白靶點（人源）。

1.2 高血壓靶點篩選在疾病基因數據庫（Genecard數據庫，https：//www.genecards.org/；OMIM數據庫，https：//omim.org/；Drugbank 數據庫，https：//www.drugbank.ca/）中 以“hypertension”“hypertensive”“essential hypertension”為關鍵詞進行檢索，收集高血壓疾病的相關基因。

1.3 網絡構建與分析將獲取到的溫膽湯活性成分的預測靶點與高血壓疾病相關靶點取交集，藥物-疾病的交集基因。利用Cytoscape 3.6.0軟件構建溫膽湯的“成分-靶點”網絡圖，探究溫膽湯活性成分和相關靶點的相互作用。然后在Tools 工具欄中的NetworkAnalyzer 模塊中選擇Analyze Network 功能對藥物進行拓撲分析。在String 數據庫（http：//stringdb.org/），通過交集得到的靶點構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。物種設為“Homo sapiens”(人類)，最低相互作用閥值設為最高置信度0.9“highest confidence”，其余參數保持默認設置。然后借助Cytoscape 3.6.0軟件中CytoHubba 插件，依據MCC 得分進行核心（Hub）基因的篩選，選出得分排名前10位的基因。

1.4 基因本體論（GO）分類富集分析及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析利用R軟件中的BiocManager 軟件包對上述交集基因進行GO和KEGG通路富集分析。

1.5 溫膽湯治療高血壓的成分及機制的文獻驗證通過檢索國內外文獻，分析溫膽湯治療高血壓的相關成分與機制，為網絡藥理學所預測的結果提供文獻驗證。

2 結果

2.1 活性成分篩選及靶點篩選本研究中半夏、陳皮、茯苓、甘草、枳實五味藥物的化學成分通過TCMSP 數據庫獲得，竹茹化合物的基本信息通過化學專業數據庫獲得，通過限定OB≥30%和DL≥0.18進行篩選，剔除未找到靶點的化學成分，共得到236個活性成分，預測靶標2179個，見表1。將預測靶標去除重復值后，得到312個靶點。表2中列舉出了溫膽湯中靶點數排前10位的成分信息。

表1 溫膽湯“中藥-活性成分-預測靶標”信息

表2 溫膽湯靶點數前10位成分信息

2.2 疾病靶點篩選結果通過Genecard數據庫檢索出高血壓疾病相關基因735個，OMIM 數據庫中獲得97個基因，Drugbank數據庫中獲得16個基因，去除重復基因后，最后獲得816個高血壓疾病基因。

2.3 網絡構建與結果分析將所得到的溫膽湯的藥物靶點與高血壓相關靶點進行映射，得到94個共有靶點，對應溫膽湯活性成分142個。利用Cytoscape軟件構建藥物-靶點網絡，見圖1。對藥物-靶點網絡的拓撲屬性進行分析，先篩選出度值（Degree）與介數（Betweenness）均大于平均值的化合物，然后依照度值大小排序篩選出前10的化合物，見表3。利用String數據庫將映射所得的94個靶點制作成PPI 網絡，限定其置信度為0.9，其產生相互作用的網絡有94個節點，229條邊，平均節點度：4.87，平均局部聚類系數：0.474，見圖2。利用Cytoscape 軟件進行Hub 基因的篩選，根據MCC算法篩選出10個得分最高的基因，即STAT3、JUN、IL6、MAPK3、VEGFA、IL1B、AKT1、TIMP1、IL4、IL2，說明這10個基因是溫膽湯治療高血壓的關鍵靶標，見圖3。

圖1 藥物-疾病交集靶點網絡

2.4 基因本體論（GO）分類富集分析及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析利用R 軟件的BiocManager 軟件包對溫膽湯治療高血壓的交集基因進行GO分類富集和KEGG 通路富集分析。依據P＜0.05進行GO 和KEGG 通路富集分析，其中富集靶標越多、P值越小的通路，與溫膽湯治療高血壓的關系越為密切，分別篩選出前10條GO 條目和前20條KEGG 通路。GO 分類富集分析包括細胞組分（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）3個部分。通過GO分類富集分析確定了1837個條目，其中涉及生物過程的有1686條，涉及細胞組成的有61條，涉及分子功能的有90條，見圖4。通過KEGG 通路富集分析，找到了126條信號通路，主要包括糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化通路、TNF信號通路、松弛素信號通路、HIF-1信號通路、IL-17信號通路等，見圖5。

表3 度值前十的化合物

圖2 溫膽湯治療高血壓疾病PPI網絡

圖3 溫膽湯治療高血壓疾病的Hub基因

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

2.5 文獻驗證溫膽湯的臨床應用范圍較為廣泛，主要用于治療“痰”“氣”(郁)“熱”(火)為病機的多種疾病，包括精神神經系統、循環系統、呼吸系統、消化系統等方面疾病。方中以法半夏燥濕化痰為主藥；痰因氣滯，陳皮利氣祛痰；茯苓健脾滲濕，使濕去而痰消；炙甘草補土和中；竹茹清脾胃郁熱，枳實破滯助法半夏消痰；全方具有清痰利氣調達氣機之功。研究表明，槲皮素具有降壓、降低血中低密度脂蛋白濃度的作用[10-11]；柚皮素具有抗動脈粥樣硬化的作用[12]；川皮苷對NO 有雙向調節作用，對血管內皮細胞具有一定的保護作用[13]。溫膽湯可以減輕內皮細胞中由同型半胱氨酸引起的氧化應激反應，通過下調TNF-α/p38、MAPK／NF-κB 信號傳導，緩解內皮細胞炎癥損傷，進而對內皮產生一定的保護作用，最終達到降血壓、抗動脈粥樣硬化、抗血栓等作用[14]。

3 討論

中藥現代化、科學化的難點和問題關鍵在于中藥復方成分較為復雜，多成分間存在協同作用，存在著復雜化學體系的物質基礎和作用機理[15]。而網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對生物系統的網絡分析，選取特定信號節點進行多靶點藥物分子設計的新學科。中藥網絡藥理學的主要目的是尋找適合中醫藥體系研究的模式和方法。中藥網絡藥理學通過構建“成分-靶點-疾病”復雜網絡，從整體和系統出發，闡釋和分析研究對象的藥理學機制，與中藥多成分-多靶點的作用模式不謀而合，為研究中藥成分復雜作用機制提供新的思路[16]。

本研究篩選出溫膽湯與高血壓疾病的交集基因94個，構建出藥物-靶點網絡，進一步進行拓撲分析，找出槲皮素、柚皮素、川皮苷、山奈酚、木犀草素等10種溫膽湯治療高血壓的關鍵活性成分。槲皮素、柚皮素、川皮苷、山奈酚、木犀草素、刺芒柄花素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮均屬于黃酮類化合物，具有抗炎，降壓，降低血管的脆性，改善血管的通透性，降低血脂和膽固醇，擴張血管，抗血凝等作用[13]。結合文獻驗證，說明溫膽湯治療高血壓的分子機制具有科學性。

同時將94個交集基因構建成PPI 網絡，再根據MCC算法篩選出得分排前10的溫膽湯治療高血壓的關鍵靶標，即STAT3、JUN、IL6、MAPK3、VEGFA、IL1B、AKT1、TIMP1、IL4、IL2。其中STAT3信號通路可釋放白細胞介素（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）等炎癥因子，從而損傷心肌微血管內皮細胞[17]。JUN 是激活蛋白-1（AP-1）家族中生物活性最強的一員，AP-1是高血壓心室肥厚發展過程中的重要轉錄因子，調控心鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）等心肌肥厚早期應答基因[18]。IL6、IL4、IL2、IL1B均屬于白細胞介素（IL）家族成員，它們與高血壓的發生發展過程密切相關[19]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是信號從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者。ERK1（MAPK3）是在哺乳動物中發現的第一個絲裂原活化蛋白激酶，ERK1通路的激活具有一定的抗氧化、抗炎，保護心肌細胞等作用[20]。血管內皮生長因子A(VEGFA)普遍存在于各組織器官中，主要生理功能是促進血管新生，在高血壓導致的血管重建中具有調控作用[21]。AKT 是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶，在心肌肥厚和重塑中起著重要作用，在高血壓心肌纖維化中，AKT1的表達及激活介導了炎癥細胞作用下的成纖維細胞轉分化[22]。

本研究通過KEGG 通路富集分析，找到了126條信號通路，主要包括糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化通路、TNF 信號通路、松弛素信號通路等通路。表明上述信號通路在溫膽湯治療高血壓疾病中發揮重要的作用，值得進一步研究。晚期糖基化終產物（AGEs）是通過蛋白質、脂類和核酸的非酶糖基化和氧化而產生的，通過蛋白質交聯或與細胞表面受體結合從而促進心臟功能障礙的發生[23-24]。有研究顯示[25]，糖尿病患者體內產生的AGEs 通過激活AGE-RAGE信號通路，然后激活FSTL1的表達，從而促使IL-1β、TNF-α等炎性因子的表達，進一步導致動脈粥樣硬化的發生。流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路是導致動脈粥樣硬化的重要機制。TNF信號通路與炎癥反應有關，參與動脈粥樣硬化的發展過程[26]。

本研究利用網絡藥理學方法對溫膽湯治療高血壓進行了分析，初步揭示了溫膽湯治療高血壓的潛在活性成分、作用網絡和潛在作用機制，為進一步探討其發揮作用的藥效物質基礎和作用機制研究提供方向，其后續尚需系統的靶點驗證和體內外實驗證實其功效網絡的內在關聯和作用靶點集合。