大花黃牡丹花粉萌發及貯存特性*

賈文慶王艷麗郭英姿王政齊慶閆三妮劉會超何松林

(1.河南科技學院 河南省園藝植物資源利用與種質創新工程研究中心 新鄉 453003；2.河南農業大學風景園林與藝術學院 鄭州 450002； 3.洛陽國家牡丹園 洛陽 471011)

大花黃牡丹(Paeonialudlowii)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)肉質花盤亞組(Subsect.Delavayanae)落葉大灌木，為西藏特有植物，自然僅在林芝、米林、隆子縣等有零星分布，生長勢強，高達2～3.5 m，是牡丹最高大的種質，花鮮黃色，是金黃色牡丹品種來源的主要親本，秋葉紅色，觀賞價值極高； 其根、花瓣入藥，為名貴的藏藥之一(汪松等，2004)。大花黃牡丹多數僅有1個心皮，結實率少，加之生境干擾嚴重和人為盜掘毀壞等原因，致使其野生種群數量大幅減少，處于瀕危狀態，現被列為國家二級保護植物(李嘉玨等，1998； 洪德元等，1999； 汪松等，2004； 楊小林等，2007)。芍藥屬野生種質資源中僅有黃牡丹(Paeoniadelavayivar.lutea)、大花黃牡丹具有黃色的基因，栽培牡丹除紫斑牡丹(Paeoniarockii)、楊山牡丹(Paeoniaostii)外，大多數種類植株低矮、生長纖弱，黃色品種少，嚴重制約了牡丹的應用推廣。因此，研究分析大花黃牡丹花粉的貯存特性，對于開展芍藥屬植物的種間雜交育種工作，培育具有自主知識產權的株型高大、黃色系牡丹品種具有重要意義。

牡丹現已確認的9種野生種質及居群分布在華北、西北、西南、華中等地區，區域跨度大，花期存在較大差異，雜交需要貯存花粉，花粉低溫或超低溫貯存能夠延長花粉的壽命，是隨時隨地為授粉雜交提供足量可育花粉的有效方法，檢測花粉萌發率是遠緣雜交前的基礎性工作，花粉離體萌發技術是評價花粉萌發率以及花粉是否貯存成功的可靠手段(Akhondetal., 2000； Shekarietal.，2016； Sorkhehetal.，2018； Lietal.，2019)。近年來，越來越多的研究發現，花粉貯存期間的萌發率與活性氧、自由基的清除機制及膜質過氧化程度有關(譚健暉，2011； 劉艷萍等，2013； 賈文慶等，2015； Liuetal.，2020)，氧化應激引起的細胞損傷甚至細胞凋亡可能是貯存花粉萌發率下降的主要原因之一(石印等，2015； 徐瑾等，2015； Renetal.，2020)。以往關于大花黃牡丹的研究主要集中在分類學、生態學(蘇建榮等，2010； 楊翔等，2010)、遺傳學(林啟冰等，2004； 唐琴等，2012)、孢粉學(何麗霞等，2005； 曾秀麗等，2009)等方面，芍藥屬不同牡丹種質花粉萌發適宜的培養基差異較大(蓋偉玲等，2010； 律春燕等，2010； 賈文慶等，2012； 施江等，2013)，王士泉等(2012)報道了大花黃牡丹花粉的育性情況，但僅限于用孔雀綠-醋酸洋紅測定花粉生活力，而關于培養基成分對花粉萌發，不同貯存溫度對花粉壽命及細胞內生理指標的影響，尚未見報道。因此，本試驗以大花黃牡丹隆子縣居群花粉為試驗材料，對其花粉萌發特性、低溫下花粉的貯存特性進行研究，并測定貯存期間抗壞血酸(AsA)含量等生理指標的變化，旨在找出大花黃牡丹花粉短期、中期和長期貯存的適宜溫度，并明確貯存期間不同溫度下大花黃牡丹花粉萌發率降低的生理機制，為進一步開展大花黃牡丹的雜交育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大花黃牡丹花粉采自西藏隆子縣，2018年5月上中旬9:00—11:00，采集含苞待放的大花黃牡丹花朵，迅速放入冰盒，在實驗室將花萼和花瓣剝去，去除花柄，然后倒置放入培養皿中，置于(22±1) ℃培養箱內散粉，24 h后取出花朵，左手用鑷子夾住倒置的花朵，右手用鑷子輕彈，收集花藥開裂散出及掉落的花粉。將收集的花粉分成2份，一份直接用于花粉萌發的測定； 另一份30 ℃鼓風干燥箱干燥24 h后(含水量降至6.5%±0.5%)，分裝至2 mL帶蓋離心管中蓋口貯存，備用。

1.2 花粉萌發試驗及花粉掃描電鏡觀察

在前期牡丹花粉萌發研究(賈文慶等，2020)基礎上，采用L9(34)正交試驗設計，一個對照(表1)，對硼酸、蔗糖、GA3、CaCl2進行4因素3水平的正交試驗，每培養基(5 g·L-1瓊脂，pH6.0)處理重復3次。培養基配制后，分裝至35 mm一次性培養皿中，冷卻后，將1.1收集的新鮮花粉放入1 mL蒸餾水中，充分攪拌制成懸浮液，然后用滴管將懸浮液移至培養基上，用涂布棒涂布均勻，然后放入盛有少量水的大號培養皿里，加蓋。置于25 ℃下恒溫培養18 h后，在光學顯微鏡下統計花粉萌發率，每樣品觀察200粒以上，以花粉管長度大于花粉粒直徑作為花粉萌發標準。花粉飽滿率觀察方法如下：將1.1收集的花粉酒精梯度脫水后，將花粉均勻撒在粘有雙面導電膠的圓形電極板上，噴金后在日立SU-1510掃描電鏡下觀察花粉并進行拍照，統計飽滿的花粉比率。

1.3 不同貯存溫度對花粉萌發和花粉壽命的影響試驗

將1.1所得的大花黃牡丹干燥花粉分成5份，每份分裝20～30個2 mL帶蓋離心管(將花粉裝入放有1～3粒變色硅膠的離心管，每管1.2 g左右花粉，封口貯存)，分別放在室溫(地下室陰涼干燥處，18～25 ℃)、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃、-196 ℃(放入液氮罐中，定期添加液氮)下貯存。貯存第24、40、72、120、184、264、365天后，分別從5種溫度中取1～2只離心管，取少許花粉用2.1節最佳培養基檢測萌發率(冷凍下花粉經35 ℃水浴快速化凍)，確定5種溫度下的花粉壽命(花粉壽命=花藥散粉到萌發率降低到50%時所經歷的天數)，其余花粉用于保護酶活性等生理指標測定。

1.4 不同貯存溫度對丙二醛(MDA)和抗壞血酸(AsA)含量的影響試驗

MDA含量采用北京索萊寶科技有限公司提供的試劑盒測定：稱取約0.100 g花粉，加入1 mL提取液進行冰浴勻漿； 8 000×g4 ℃離心 10 min，取上清，置冰上待測。混合液在 100 ℃水浴中保溫60 min后(蓋緊，防止水分散失)，置于冰浴中冷卻，10 000×g常溫離心10 min。取上清至1 mL玻璃比色皿中，測定各樣品在450 nm、532 nm和600 nm處的吸光度，換算出MDA含量。

AsA含量測定成分提取方法與MDA相同，反應體系參照李合生等(2000)的方法，采用分光光度計測定525 nm處的吸光度值，根據制作的標準曲線確定抗壞血酸的含量。

1.5 不同貯存溫度對3種保護酶活性的影響試驗

酶液的提取參照賈文慶等(2020)方法。超氧化物岐化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用可見光分光光度法測定(李合生等，2000)。

1.6 數據分析

采用EXCEL2016處理數據和作圖，并利用SPSS22.0進行方差分析、多重比較。

2 結果與分析

2.1 大花黃牡丹花粉萌發適宜培養基的篩選及花粉飽滿率觀察

不同正交組合處理培養基對大花黃牡丹花粉萌發率影響的研究結果(表1)表明，不同培養基條件下花粉萌發率存在顯著差異(P<0.01)，其中處理5萌發率最高，平均達92.10%，對照無任何添加物的培養基萌發率最低，平均僅為23.50%，這表明大花黃牡丹花粉雖然能夠借助于自身積累的養分萌發，但萌發率較低。采用EXCEL2016 對花粉萌發率數據進行直觀分析，蔗糖、硼酸、CaCl2和GA34因素的極差(R)分別為23.78、19.86、6.78、6.34，可以確定對花粉萌發的誘導效應表現為蔗糖>硼酸> CaCl2> GA3。根據分析結果，確定大花黃牡丹花粉萌發的最優組合為120 g·L-1蔗糖+45 mg·L-1硼酸+55 mg·L-1GA3+30 mg·L-1CaCl2，其萌發率顯著高于其他組合。統計觀察發現，大花黃牡丹隆子縣居群單株開花3～8朵(圖1A)，秋葉猩紅(圖1B)，每朵花的花粉量平均干質量在(180±32) mg，果實多為單心皮蓇葖果(圖1C)。掃描電鏡結果顯示，畸形花粉有勺形、三角形、不規則形等，總量較少，僅占觀察花粉總數的5.6%，花粉飽滿率高達94.4%，飽滿率與萌發率基本符合(圖1D、E)。

表1 不同培養基對大花黃牡丹花粉萌發率的影響①Tab.1 Effects of different medium on pollen germination of Paeonia ludlowii

圖1 大花黃牡丹植株狀態及花粉飽滿率Fig. 1 Plant status and pollen plumpness rate of Paeonia ludlowiiA.開花狀態； B.示紅葉； C. 示單心皮； D, E. 畸形花粉。A. Flowering state; B. Red leaf; C. A follicle with only one carpel; D, E. Deformed pollen.

2.2 不同貯存溫度對花粉壽命的影響

花粉貯存是人工保存種質資源的重要手段。不同貯存溫度和處理時間對花粉萌發率的影響差異較大(P<0.01)(圖2)，除-196 ℃外，其他4個貯存溫度下，大花黃牡丹花粉萌發率均隨時間延長而下降。室溫下貯存花粉萌發率隨時間延長迅速降低，說明越來越多的花粉快速喪失發芽力，貯存24天花粉萌發率47%，為貯存前新鮮花粉萌發率的50.87%； 貯存第72天時，萌發率降為0，花粉死亡，說明冷涼干燥下花粉貯存壽命為24天。4 ℃貯存72天花粉萌發率為49%，120天時萌發率降為15%，這說明4 ℃下花粉壽命大概為80天左右，第264天時花粉萌發率降為0。-20 ℃、-80 ℃和-196 ℃貯存下花粉萌發率下降趨勢不同。-20 ℃下0～365天時，花粉萌發率呈快速下降趨勢，貯存第120天，花粉萌發率55%，貯存第184 天，萌發率降為32%，說明-20 ℃下花粉壽命120～184天； -80 ℃下貯存，花粉萌發率緩慢下降，而-196 ℃貯存下萌發率曲線保持平緩，貯存第365天，-80 ℃花粉萌發率為62.10%，達到貯存前花粉萌發率的66.23%，-196 ℃貯存下花粉萌發率為92.1%，為貯存前萌發率的99.67%，這表明-80 ℃和-196 ℃花粉壽命均大于1年，-196 ℃更適合花粉的長期貯存，而-80 ℃適合隔年雜交的花粉貯存。綜上所述，大花黃牡丹花粉貯存的最佳溫度為-196 ℃。

2.3 不同貯存溫度及時間對大花黃牡丹花粉MDA含量的影響

MDA含量是花粉細胞膜質過氧化的重要指標，大花黃牡丹花粉在不同貯存環境中MDA含量變化如圖3所示。室溫、4 ℃貯存，花粉MDA含量先升高而后快速降低，室溫下首先達到峰值，4 ℃下隨后出現高峰； 室溫下MDA含量變化相對較大，貯存72天后，升高到24 μmol·g-1(FW)，為貯存前的5.21倍； 4 ℃貯存184天，MDA含量峰值達20.5 μmol·g-1(FW)； 隨后，2個貯存溫度下MDA含量迅速下降，推測可能是花粉細胞凋亡，MDA分解造成的。-20 ℃下MDA則呈現逐漸升高的趨勢，貯存第365天時MDA含量達到貯存前的4.49倍，說明花粉細胞膜質過氧化嚴重； 而-80 ℃條件下，大花黃牡丹花粉MDA含量呈緩慢上升的趨勢，貯存第365天MDA含量升高到7.8 μmol·g-1(FW)，為貯存前的1.69倍； -196 ℃下，大花黃牡丹花粉MDA含量總體穩定，貯存365天后，MDA含量與貯存前無顯著差異，這表明花粉細胞在-196 ℃貯存下并未造成膜質過氧化，花粉萌發率高。

圖3 不同貯存溫度及時間對大花黃牡丹花粉丙二醛含量的影響Fig. 3 Effects of different storage temperature and time on MDA content in pollen

2.4 不同貯存溫度及時間對大花黃牡丹花粉SOD活性的影響

不同貯存溫度及處理時間對SOD活性有顯著影響(P<0.01)(圖4A)。室溫下貯存，大花黃牡丹花粉SOD活性隨時間延長總體呈迅速下降趨勢，SOD活性的降低可能是花粉死亡較多，只有少部分花粉具有SOD活性造成的。4 ℃和-20 ℃下貯存，SOD活性升高，分別在第24天、第72天達到峰值，此后隨著貯存時間的延長，SOD活性迅速下降，4 ℃下貯存第264天花粉萌發率降為0，SOD活性僅為3 U·g-1(FW)，-20 ℃下貯存第365天，SOD活性僅為最高峰值的23.90%，這表明，此時SOD已不足以抵抗花粉膜質過氧化導致的傷害，花粉萌發率也出現了大幅下降。-80 ℃貯存條件下，SOD活性呈先緩慢上升隨后下降再逐漸上升的趨勢，但總體變化幅度比較平緩，貯存第365天，SOD活性達到貯存前的1.65倍，這表明大花黃牡丹花粉清除活性氧的能力強，花粉仍具有較高活性。而-196 ℃液氮貯存條件下，SOD活性基本保持穩定，貯存期間SOD活性無顯著變化，花粉萌發率與新鮮花粉無顯著差異，SOD活性124 U·g-1(FW)，為貯存前的1.07倍，這表明大花黃牡丹花粉細胞內代謝穩定，沒有受到傷害或傷害較小，因此花粉萌發率高。

2.5 不同貯存溫度及時間對大花黃牡丹花粉POD活性的影響

大花黃牡丹花粉經過不同貯存溫度和時間處理后，POD活性變化顯著(P<0.01)(圖4B)。花粉POD活性在室溫、4 ℃、-20 ℃下，先升高而后降低。室溫下第24天，POD活性升至59 U·g-1(FW)，達到最高，為原來的2.32倍，之后隨著時間的增長，大花黃牡丹花粉自身的保護能力迅速下降，POD合成受到抑制，至貯存第264天，降為0； 4 ℃貯存，大花黃牡丹花粉的POD酶活性最高峰值出現在第72天，之后隨著時間增長，POD酶活性開始迅速下降，到第264天時，活性僅為貯存前活性的8%； -20 ℃，POD活性最高峰值出現在第120天，之后伴隨著花粉萌發率的下降而迅速下降，貯存365天，POD酶活性僅為3.5 U·g-1(FW)。-80 ℃貯存，POD酶活性同樣呈先升高后下降的趨勢，最高峰出現在第184天，之后下降。-196 ℃貯存條件下，POD酶活性整體波動較小，趨勢平緩，365天時活性是原來的1.04倍，這表明超低溫下，花粉內部代謝處于平衡狀態，自由基產生較少，低POD酶活性協同其他保護酶及其他成分等能夠及時分解自由基，保證花粉細胞內部代謝穩定，因而花粉活力較高。

2.6 不同貯存溫度及時間對大花黃牡丹花粉CAT活性的影響

不同貯存溫度對CAT活性的影響顯著(P<0.01)(圖4C)，室溫、4 ℃、-20 ℃貯存條件下，大花黃牡丹花粉的CAT活性首先升高，分別在第24天、第40天、第120天達到峰值，之后隨著貯存時間的延長，室溫、4 ℃下花粉CAT活性迅速下降，分別在貯存第264天和第365天降為0； -20 ℃下，在第120天花粉CAT活性達到峰值后快速下降，貯存第365天，花粉CAT活性僅為24 mg·g-1(FW)。-80 ℃貯存溫度下，隨著貯存時間的延長，大花黃牡丹花粉的CAT活性總體上呈起伏不定的曲線，第365天最高峰值達91 mg·g-1(FW)，為原來的1.25倍； -196 ℃貯存溫度下，CAT活性呈現震蕩下降再上升而后下降的趨勢，但幅度極為平緩，與貯存前無顯著差異。這表明隨著時間的推移，花粉可以在低溫下分解自由基，從而減少損害，保持較高的生存能力。

圖4 不同貯存溫度及時間對大花黃牡丹花粉酶活性的影響Fig. 4 Effects of different storage temperature and time on enzymatic activity in pollen

2.7 不同貯存溫度及時間對大花黃牡丹花粉AsA含量的影響

AsA是細胞體內重要的抗氧化劑，由圖5可以看出，大花黃牡丹花粉經過不同貯存溫度和時間處理后，AsA含量變化顯著不同(P<0.01)。室溫、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃貯存條件下，大花黃牡丹花粉AsA含量隨著時間的延長，呈現先升高后迅速下降的趨勢，室溫、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃的高峰值分別出現在第24、72、120、184天，之后除-80 ℃貯存溫度外，伴隨著花粉萌發率的下降，花粉AsA含量均迅速下降； 而-196 ℃貯存溫度下，花粉AsA含量先出現震蕩隨后呈略為上升的趨勢，365天時AsA含量為3.25 mg·g-1(FW)，僅為原來含量的1.19倍，這表明此時花粉可以清除保護酶不能清除的超氧陰離子自由基、羥自由基等自由基，進而保護花粉減少低溫傷害，保持較高的花粉萌發率。

圖5 不同貯存溫度及時間對大花黃牡丹花粉AsA含量的影響Fig. 5 Effects of different storage temperature and time on AsA content in pollen

2.8 大花黃牡丹花粉萌發率與生理指標的相關性

由相關性分析結果(表2)可知，大花黃牡丹花粉萌發率與MDA含量呈顯著負相關關系，與AsA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性呈顯著正相關(P<0.01)，SOD活性與花粉萌發率相關系數達0.816 5，這表明大花黃牡丹花粉在5個貯存溫度下，SOD活性是影響花粉萌發、花粉壽命的最主要因子，其他主要影響因子依次是CAT活性、AsA含量和POD活性； 膜質過氧化是導致花粉凋亡的主要因素。表2表明，MDA含量與SOD呈顯著負相關，與POD、CAT、AsA呈負相關，SOD、POD、CAT、AsA含量相互呈顯著正相關，這說明大花黃牡丹花粉中3種保護酶和AsA含量協同作用較強，花粉SOD可以有效清除活性氧過多積累造成的花粉細胞膜質過氧化。

表2 花粉萌發率、MDA、AsA含量以及3種保護酶活性的相關分析①Tab.2 Correlation between pollen germination, protective enzymes activity, MDA, and AsA content

3 討論

3.1 不同培養基及不同貯存方法對花粉萌發的影響

蔗糖、H3BO3、Ca2+和GA3是花粉萌發率離體檢測最常用的添加物 (Feietal.，2003； Gokbayraketal.，2017； Flores-Renteriaetal.，2018)。其中，蔗糖不僅為花粉的萌發和花粉管的生長提供了必要的能量，而且在一定程度上維持了外界環境的滲透壓，保證了花粉的萌發 (Hiroseetal.，2014)； H3BO3可以增加花粉細胞對糖的攝取、轉運和代謝，誘導Ca2+從外界進入細胞，建立花粉管頂端生長所需的Ca2+梯度； Ca2+在花粉管極性生長和生長方向的調節中具有重要的作用(Renetal.，2020)； GA3對花粉萌發和花粉管生長有重要作用，低濃度GA3可顯著提高杏(Prunusarmeniaca)花粉萌發率(Feietal.，2003； Gokbayraketal.，2017； Flores-Renteriaetal.，2018)。植物基因型不同，適宜的花粉檢測培養基亦不同，芍藥屬植物花粉萌發適宜的蔗糖濃度為50～150 g·L-1，硼酸濃度30～100 mg·L-1(李秉玲等，2010； 律春燕等，2010； 賈文慶等，2012； 施江等，2013)。本試驗結果也證實了這一點，蔗糖、H3BO3、Ca2+、GA3不同組合對大花黃牡丹花粉萌發有顯著影響，萌發適宜的蔗糖濃度達120 g·L-1，高于矮牡丹(Paeoniajishanensis)的90 g·L-1(賈文慶等，2012)，低于黃牡丹的150 g·L-1(律春燕等，2010)，這表明不同牡丹野生種質花粉適宜的培養基不同。花粉萌發率與飽滿率具有相關性(賈文慶等，2012； 王士泉等，2012)，本試驗發現，大花黃牡丹隆子縣居群開花多、花粉量大，花粉畸形率較低，平均僅5.6%，結合萌發率(可育花粉率)90%以上來分析，二者具有關聯，飽滿率高可能是大花黃牡丹新鮮花粉萌發率較高的原因，這與成仿云等(1997)研究發現種子是大花黃牡丹唯一的繁殖途徑是一致的，表明大花黃牡丹具有較強的有性生殖能力。

貯存后生物材料生存力的變化是用來決定貯存成功與否的重要指標，不同牡丹種質花期不同，自然情況下牡丹花粉壽命僅有3～15天，因此雜交需要貯存花粉，合適的貯存環境對于大花黃牡丹花粉延長壽命進而通過雜交選育優良新品種具有重要意義。研究表明，芍藥屬植物花粉壽命的長短受多方面因素的制約。一是受其基因型的控制，基因型不同，花粉壽命差異明顯(李秉玲等，2010； 賈文慶等，2012； 石印等，2015)； 二是花粉含水量是影響花粉壽命的主要因素之一，低含水量是延長花粉壽命的有效手段，含水量6%～13%的芍藥屬種質花粉貯存壽命長(施江等，2009； 李秉玲等，2010； 石印等，2015)。此外，貯存的環境極為重要，低溫、干燥和低氧環境可有效延長花粉壽命，在應用較多的室溫干燥、低溫干燥、冷凍干燥貯存和超低溫貯存中，4 ℃貯存芍藥屬種質花粉壽命為20～60天，-20 ℃貯存條件下花粉壽命為30～120天，而在-80 ℃、-196 ℃貯存環境中，矮牡丹、日本牡丹‘島大臣’(Paeoniasuffruticosa‘Shimadaijin’ )、牡丹‘鳳丹白’(Paeoniaostii‘Fengdan Bai’)等花粉壽命均超過1年，尤以-196 ℃液氮貯存條件下萌發率最高(施江等，2009； 李秉玲等，2010； 賈文慶等，2012； 石印等，2015)。本研究也證實了這一點，室溫干燥下，大花黃牡丹花粉壽命僅有24天，而4 ℃、-20 ℃環境花粉壽命在3～4個月，分析可能是較高的溫度下花粉生理代謝較強，造成大量花粉發芽力喪失； -80 ℃、-196 ℃貯存1年的花粉萌發率分別達新鮮花粉的66.23%、99.67%，這表明大花黃牡丹花粉在這2種溫度下花粉壽命均超過1年。以上結果表明，低溫特別是超低溫是大花黃牡丹花粉長期貯存的最佳環境，可能是低溫降低了花粉的生理代謝，進而延緩衰老延長了花粉壽命。綜上所述，-80 ℃由于經濟適用，適宜大花黃牡丹跨年雜交花粉的貯存，而-196 ℃適合大花黃牡丹花粉的長期貯存。

3.2 花粉萌發率與MDA、AsA含量及保護酶的關系

植物體內自由基、活性氧的產生與清除是平衡的，在正常生長條件下自由基、活性氧水平較低，低水平的自由基、活性氧不會造成損傷，且有一定的積極作用(Kanazawaetal.，2000)。在逆境或程序性死亡過程中，細胞內活性氧、自由基種類數量大幅度增多，活性氧產生與清除的平衡被打破，損害生物膜及功能，植物一般通過提高抗氧化酶活性、合成AsA等抗氧化物質啟動防御系統，減少或避免對細胞功能的傷害(Liuetal.，2020； Renetal.，2020)。MDA是植物細胞膜系統受害、細胞凋亡的主要標志物，測定MDA可以推斷貯存環境對花粉細胞是否造成傷害及傷害的程度(Dongetal.，2018； Zafraetal.，2018)。SOD在控制超氧陰離子的積累以防止膜脂質和蛋白質的氧化損傷中起著至關重要的作用，但SOD升高也增加了細胞中H2O2的濃度，而CAT、POD和其他抗氧化酶可以平衡H2O2的含量(Renetal.，2020)，且POD能消除酚、胺、醛、苯等的毒性 (Liuetal.，2020)。此外，某些引起植物氧化損傷的劇毒活性氧成分，例如不能被SOD、POD、CAT等抗氧化酶清除的超氧陰離子和羥自由基，也是引起細胞氧化損傷的主要因素，因此植物只能依靠非酶類物質去除這些活性氧成分(Boseetal.，2014)，AsA是非酶抗氧化劑系統中的關鍵成分，是最有效的抗氧化劑之一，AsA不僅與H2O2反應，而且與超氧陰離子自由基、羥自由基和脂質過氧化物反應，從而維持活性氧的平衡狀態，保護細胞膜并參與其他抗氧化劑的再生(Renetal.，2020)。

室溫、4 ℃貯存條件下，大花黃牡丹花粉萌發率、MDA含量、AsA含量、3種保護酶活性的變化規律相似，隨著貯存時間的延長，花粉萌發率快速降低，MDA含量、AsA含量、3種保護酶活性基本呈升高然后迅速降低的趨勢，這可能是因為貯存初期，在外界溫度和水分的脅迫下，花粉代謝紊亂，自由基增加，MDA增加膜質過氧化加劇，為了維持代謝平衡，花粉細胞SOD、POD、CAT活性增加，合成AsA，協同花粉內的脯氨酸、維生素E等清除過多的自由基、活性氧，以維持細胞膜的穩定性。但隨著貯存時間的延長，活性氧、自由基的過度積累導致細胞損傷嚴重，沒有過多的保護酶、AsA來防止損傷，出現氧化應激，細胞受到損傷，花粉逐漸衰亡，因此花粉萌發率迅速下降。室溫下，SOD活性逐漸下降，POD活性在第24天，CAT活性、AsA含量在第40天達到高峰值，MDA含量第72天達到峰值； 而在4 ℃條件下，3種保護酶、AsA含量在第24天、第72天達到峰值，MDA含量則第184天才達到峰值，較室溫推遲112天，與SOD、CAT相比，POD、AsA含量的峰值推遲，在-20 ℃和-80 ℃時更明顯。這表明，與室溫相比，4 ℃下花粉活性氧積累較慢，膜系統傷害來得較遲，MDA含量達到峰值后下降可能是細胞凋亡后，MDA分解造成的； POD、AsA含量的峰值推遲可能是因為貯存時花粉細胞不僅產生SOD、CAT可以清除的活性氧，還可能產生其他有毒物質，如超氧陰離子自由基、羥自由基、胺或酚類物質(Fecht-Christoffersetal.，2006； Liuetal.，2020)。

-20 ℃貯存下，貯存初期(第0～40天)大花黃牡丹花粉萌發率下降緩慢，SOD、POD活性及AsA含量持續增加，而CAT活性則在下降后緩慢上升，MDA含量則緩慢上升，可能是在這一時期花粉通過協調3種類型的保護酶、AsA含量來維持自由基的產生和消除之間的平衡，從而維持花粉發芽力。隨著貯存時間的延長，花粉萌發率明顯下降，MDA含量持續上升，SOD活性在第72天出現高峰后迅速下降，而POD、CAT活性及AsA含量則在120天達到高峰隨后下降，這表明第72天到120天，花粉中活性氧種類及其他有毒物質如酚類或胺類物質在增加，花粉通過不斷增加POD、CAT活性及AsA含量消除這些有毒物質，從而減緩花粉活性的喪失(Fecht-Christoffersetal.，2006)。-20 ℃貯存第365天后，花粉萌發率僅為貯存前萌發率的12.9%，分析可能是因為在大多數花粉中，自由基、活性氧積累過多，膜質過氧化嚴重，花粉細胞損傷加劇，導致花粉無法萌發，只有一小部分花粉能夠產生保護酶、AsA來維持活性(賈文慶等，2015)。譚健暉(2011)的研究表明，在-20 ℃貯存358天后，馬尾松(Pinusmassoniana)的花粉仍然保持較高的萌發率(42.20%)和較強的抗氧化能力。這表明由于遺傳因素的不同，不同植物花粉的萌發和貯存特性不同。

-80 ℃貯存的早期(第0～72天)，大花黃牡丹花粉通過增加SOD活性、AsA含量來維持內部代謝平衡，花粉萌發率緩慢下降； 貯存第72～184天，MDA含量持續增加，SOD活性不斷上升，CAT活性在下降后又上升，POD活性、AsA含量則持續上升，分別在第120、184天達到高峰，這表明此階段活性氧持續增加，需要協調3種保護酶及AsA含量清除有毒物質維持花粉活性。貯存后期(184～365天)，花粉中的活性氧逐漸積累，MDA含量逐漸增加顯示膜質過氧化逐漸加重，導致花粉萌發率逐漸下降，為了消除細胞中過多的活性氧，細胞SOD活性升高，在此期間，細胞內的其他有毒物質可能逐漸減少，所以細胞只需要增加CAT活性來清除H2O2，因此，POD活性、AsA含量緩慢下降，而CAT活性逐漸增加。因此，在花粉貯存過程中，影響花粉萌發率的不僅是活性氧，還有其他有毒物質，具體還需要進一步的研究。綜合來看，大花黃牡丹-80 ℃貯存期間，花粉3種保護酶、AsA含量、MDA含量總體變化幅度較-20 ℃、4 ℃、室溫下小，這可能是大花黃牡丹花粉貯存1年后萌發率仍保持在較高水平的原因。

許多植物花粉在超低溫貯存時出現“冷刺激”現象，日本牡丹、矮牡丹等芍藥屬植物花粉也有類似發現(李秉玲等，2010； 賈文慶等，2012)，其發生原因可能與貯存后花粉細胞內Ca2+增加、存在差異蛋白有關(李秉玲等，2010)。本研究發現，-196 ℃下大花黃牡丹花粉貯存前期(第0～40天)，花粉并非處于生理停滯狀態，同-80 ℃一樣，貯存第40天，花粉萌發率升高，出現“冷刺激”現象，較貯存前新鮮花粉分別提高1%和1.5%，伴隨著花粉萌發率的提高，花粉MDA含量降低，而SOD、POD、CAT、AsA含量升高，這表明超低溫下大花黃牡丹花粉細胞自由基、活性氧較少，膜質過氧化程度低，花粉細胞健康程度提高，推測這可能是大花黃牡丹花粉萌發率“冷刺激”現象發生的生理原因，具體有待進一步研究。貯存中后期(第40～365天)，MDA含量處于較低的水平，一直保持穩定，而SOD、CAT、POD及AsA同樣保持穩定，貯存過程中無顯著差異，這表明-196 ℃下貯存1年的過程中，花粉細胞內SOD、CAT、POD及AsA協同作用，有效清除了多余的活性氧和其他有毒物質，處于代謝平衡狀態，未造成嚴重的膜質過氧化，這是大花黃牡丹花粉貯存后萌發率仍較高的原因。

前人研究表明，馬尾松、銀杏(Ginkgobiloba)、大花紅山茶(Camelliamagniflora)、芍藥(Paeonialactiflora)等植物花粉的保護酶活性、MDA和AsA含量與萌發率具有相關性(譚健暉，2011； 劉艷萍等，2013； 賈文慶等，2015； 石印等，2015)。花粉萌發率與5個生理指標的相關分析表明，大花黃牡丹花粉在貯存過程中，SOD活性是影響花粉萌發、花粉壽命的最主要因子，其次的因子依次為CAT活性、AsA含量和POD活性； 膜質過氧化是導致花粉凋亡的主要因素。這些結果表明SOD在大花黃牡丹花粉貯存過程可以有效清除活性氧，防止或減輕膜質過氧化程度過高引起的細胞凋亡。本試驗結果表明，室溫下隨著貯存時間的延長，大花黃牡丹花粉POD活性首先快速升高后降低，隨著花粉萌發率的迅速降低，SOD活性逐漸降低，CAT則緩慢升高后降低，之后隨著貯存時間的延長3種保護酶活性均迅速降低，說明POD在室溫下較為敏感。4 ℃下，SOD和CAT在第24天同時出現峰值，但2種酶的抗氧化能力有限，脅迫的加重POD活性升高，AsA含量增加，在第72天達到峰值，之后迅速降低，與此同時，花粉萌發率迅速下降，說明花粉SOD和CAT在4 ℃下較為敏感。-20 ℃、-80 ℃下，花粉SOD活性則首先快速升高，說明SOD較為敏感。綜上所述，POD在大花黃牡丹花粉室溫貯存時為敏感的保護酶，SOD在-20 ℃和-80 ℃貯存時為敏感的保護酶，而SOD和CAT在4 ℃貯存時為敏感的保護酶，這與本試驗的相關分析一致。

4 結論

大花黃牡丹自然環境下花粉畸形率低，花粉的萌發率與飽滿率具有相關性； 適宜大花黃牡丹花粉萌發率檢測的培養基為120 g·L-1蔗糖+45 mg·L-1硼酸+55 mg·L-1GA3+30 mg·L-1CaCl2； 花粉貯存溫度直接影響大花黃牡丹的花粉萌發率，室溫適合大花黃牡丹花粉1～24天的短期貯存，4 ℃、-20 ℃適合雜交時間間隔在80～120天大花黃牡丹花粉的中期貯存，-80 ℃適合花粉的跨年貯存，而-196 ℃適合大花黃牡丹種質花粉的長期貯存； 相關性分析結果顯示，SOD活性是影響貯存期間大花黃牡丹花粉萌發、花粉壽命的最主要因子，其他因子依次為CAT活性、AsA含量和POD活性，膜質過氧化是導致花粉死亡的主要因素。花粉細胞內代謝處于動態平衡狀態、細胞膜系統穩定是-196 ℃下大花黃牡丹花粉保持高萌發率的生理響應； 室溫、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃貯存期間，花粉保護酶活性、抗壞血酸含量顯著升高后迅速降低，清除活性氧、自由基能力下降，活性氧、自由基積累過多，膜質過氧化程度加劇，細胞損傷嚴重是貯存期間花粉萌發率下降的主要原因。