不同產地沉香的高效液相色譜指紋特征*

王 茜 尚麗麗 晏婷婷 陳 媛 付躍進 李改云

(中國林業科學研究院木材工業研究所 北京 100091)

沉香為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)植物遭遇創傷后在自我修復過程中形成的含有樹脂的木材，不僅是傳統的名貴藥材，有“藥中黃金”的美譽，也是頂級的天然香料，被譽為“香中之王”(Bardenetal.，2000)，具有極高的經濟價值。由于過度開采，目前沉香屬植物均被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)附錄Ⅱ，沉香產地溯源可為其合法性提供科學依據。

沉香物種來源豐富，從南亞次大陸的東北部到印度尼西亞群島、巴布亞新幾內亞群島，分布著至少20余種沉香屬植物(Santisuk，2007)。依據產地和氣味特征，沉香習慣上被劃分為3個產地：產自中國海南、廣東、廣西等地的沉香被稱作莞香系沉香； 產自越南、柬埔寨、老撾等國的沉香被稱作惠安系沉香，也有收藏者將中國產沉香劃入惠安系(Liuetal.，2017)； 產自印度尼西亞、菲律賓、文萊、馬來西亞等地的沉香被稱作星洲系沉香。不同沉香產地主要通過氣味和滋味依賴經驗判斷，主觀性強，缺乏科學依據(Hashimetal.，2016)。近年來，反映物質所含化學成分信息的直接分析-飛行時間質譜(DART-TOFMS)、液相色譜-質譜(LC-MS)等技術在產地判別上的應用研究日趨增加，結果發現不同產地沉香所含化學成分的組成和含量差異性很大，品質也有較大差別(Espinozaetal.，2013； 李遠彬，2017； 賈東宇等，2018)，但尚無法實現產地判別。2-(2-苯乙基)色酮類化合物是沉香的重要指標性成分，對沉香鑒別具有重要意義，尚麗麗等(2018)利用沉香中共有的2-(2-苯乙基)色酮類特征成分建立了適用于野生沉香和人工沉香的高效液相特征圖譜鑒別方法，但僅是2-(2-苯乙基)色酮類的部分化合物，仍有大量化合物未被檢測和利用。目前，對于來自莞香系、惠安系、星洲系沉香2-(2-苯乙基)色酮類化合物的系統研究尚未見報道。

鑒于此，本研究針對不同地區所產沉香品質差別較大以及傳統沉香產地鑒別主要依據經驗判斷等問題，基于高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)技術進行沉香中2-(2-苯乙基)色酮類化合物的完整分析，篩選不同產地沉香的高效液相色譜指紋特征，并利用指紋特征峰變量進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA),建立沉香產地判別方法，以期為沉香資源品質評價與原產地保護提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

36批試驗樣品采自沉香主產地和市場收集，經中國林業科學研究院木材工業研究所依據LY/T 2904—2017《沉香》鑒定。其中，S1～S12為莞香系沉香，S13～S24為惠安系沉香，S25～S36為星洲系沉香。

沉香四醇對照品(成都菲德生物技術有限公司)，乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，甲酸(色譜純，美國Fisher公司)，無水乙醇(分析純，北京化工廠)，超純水(屈臣氏)。三頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，植物粉碎機(德國IKA，A11型)，萬分之一天平(德國Sartorius公司，R2000型)。

1.2 對照品溶液和樣品溶液的制備

按照尚麗麗(2018)對沉香四醇標準品和36批沉香樣品進行處理。

1.3 高效液相色譜分析

高效液相色譜儀，包括高壓二元泵、紫外檢測器、柱溫箱、自動進樣器和工作站(日本島津公司)； 色譜柱為Phenomenex luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)； 柱溫31 ℃； 檢測波長252 nm； 進樣量10 μL； 流速1.2 mL·min-1。HPLC梯度洗脫程序：0～7 min，10%～20%A； 7～13 min，20%～25%A； 13～24 min，25%～30%A； 24～40 min，30%～35%A； 40～41 min，35%A； 41～58 min，35%～42%A； 58～82 min，42%～60%A。

1.4 定性分析

超高效液相色譜-四極桿高分辨飛行時間質譜聯用儀，包括高壓二元泵、二極管陣列檢測器、柱溫箱、自動進樣器和工作站(安捷倫科技有限公司)； 色譜柱、流動相、柱溫、進樣量、流速和梯度洗脫程序同上； 質譜條件：正離子模式，碰撞氣體為氦氣，高純度氮氣作為霧化器并進行干燥，流速11.0 L·min-1； ESI源； 毛細管電壓3 500 V； 源噴射壓力130 V； 干燥氣體溫度300 ℃； 霧化器壓力30 psi； 離子掃描范圍為全掃描，掃描范圍10～1 000m/z。

1.5 方法學考察

1.5.1 精密度 采用1.2方法平行制備6份樣品溶液，在相同HPLC分析方法下進樣分析，將所得色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(以下簡稱相似度評價系統)，以沉香四醇特征峰為參照，計算主要色譜峰相對保留時間的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.5.2 重復性 采用1.2方法制備沉香樣品溶液，取同一樣品溶液，在相同HPLC分析方法下連續進樣6次，后續操作同上。

1.5.3 穩定性 采用1.2方法制備沉香樣品溶液，取同一樣品溶液，分別于0、2、4、8、24、36 h在相同HPLC分析方法下進樣分析，后續操作同上。

1.6 多元統計分析

基于相似度評價系統分析沉香HPLC數據，以沉香四醇特征峰為參照，對HPLC 圖譜其他色譜峰的保留時間和峰面積進行校正。選取時間窗寬度為0.2 min，采用中位數法多點校正自動匹配，尋找共有峰并計算相對峰面積，生成對照圖譜進行相似度計算。以共有峰相對峰面積為變量，將數據導入SIMCA-P 14.1軟件進行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)和變量投影重要性(variable importance plot，VIP)分析。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜分離條件的優化與方法學考察

沉香中2-(2-苯乙基)色酮類化合物數量眾多，結構相似，沉香四醇等8種化合物是沉香的重要指標性成分，并已針對這些成分建立了適用于野生沉香和人工沉香的高效液相特征圖譜(尚麗麗等，2018)。在保持該特征的前提下，本研究經優化色譜柱類型、流動相梯度洗脫程序和流速等分離條件，建立了適宜對沉香中2-(2-苯乙基)色酮類化合物進行完整分析的高效液相色譜方法，見1.3。

精密度試驗所得色譜峰的相似度均大于0.99，RSD為0.7%，主要色譜峰相對保留時間的RSD在0.01%～0.14%之間。重復性試驗所得色譜峰的相似度均大于0.99，RSD為0.5%，主要色譜峰相對保留時間的RSD在0～0.54%之間。穩定性試驗所得色譜峰的相似度均大于0.99，RSD為0.6%，主要色譜峰相對保留時間的RSD在0～0.49%之間。綜上可知，方法學考察中主要色譜峰相對保留時間的RSD均小于2%，圖譜相似度均大于0.9，說明該方法重復性、精密度良好，樣品在36 h內穩定，符合方法驗證學要求。

2.2 沉香高效液相色譜的產地特征分析與篩選

36批次不同產地沉香的高效液相圖譜經相似度評價系統分析，12批次莞香系沉香共得到65個共有峰(圖1)，12批次惠安系沉香共得到29個共有峰(圖2)，12批次星洲系沉香共得到36個共有峰(圖3)。結合3類沉香的共有峰圖譜，將歸屬于相同化合物的色譜峰編號合并，3個產地共統計出85個特征峰，據此建立不同產地沉香的高效液相色譜指紋圖譜(圖4)。

圖1 12批次莞香系沉香的HPLC圖譜Fig.1 HPLC characteristic chromatogram of 12 batches of agarwood of Guan-Xiang Zone

圖2 12批次惠安系沉香的HPLC圖譜Fig.2 HPLC characteristic chromatogram of 12 batches agarwood of Hoi-An Zone

圖3 12批次星洲系沉香HPLC圖譜Fig.3 HPLC characteristic chromatogram of 12 batches agarwood of Sin-Chew Zone

圖4 不同產地沉香的HPLC指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprint chromatogram of agarwood from different origins指紋圖譜中3個產地均含有的色譜峰用大寫字母A～O(共15個)標注，某2個產地共有峰用小寫字母a～p(共16個)標注，產地各自共有峰用阿拉伯數字(共54個)標注。The chromatogram peaks shared by the three origins in the fingerprints are marked with capital letters A-O(15 in total), the peaks shared by a certain two origins are marked with lowercase letters a-p(16 in total), and the peaks shared by each of the three origins are marked with Arabic numerals(54 in total).

圖5 不同產地沉香指紋圖譜熱圖Fig.5 Heatmap of chromatogram peaks in agarwood chromatographic fingerprints from different origins

根據指紋圖譜中不同產地沉香共有色譜峰信息并結合前期研究結果(尚麗麗等，2018)繪制熱圖(圖5)發現，不同產地沉香的化學成分差異在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個區域均有體現。Ⅰ區相對保留時間0～7 min，主要成分為沉香專屬性成分5，6，7，8-四氫-2-(2-苯乙基)-色酮型色酮(THPECs)(Yangetal.，2016； 尚麗麗等，2018)，3類沉香在該區域各自共有峰出峰時間和數量大致相似，僅在色譜峰強度方面有少許差異，說明不同產地沉香在該區域的化學成分相似，相對含量存在一定差別，其中星洲系沉香樣品的沉香四醇特征峰(id：I)響應值極高，可作為星洲系沉香的一個特征； Ⅱ、Ⅲ區相對保留時間18～36 min，主要成分為5，6，7，8-二環氧-2-(2-苯乙基)色酮(DEPECs)和5，6-環氧-2-(2-苯乙基)色酮(EPECs)，這2類色酮被認為是沉香色酮合成過程中的前驅體和早期中間體(Yangetal.，2016)，莞香系沉香富含這2類色酮，惠安系次之，星洲系較少； Ⅳ區域相對保留時間37～85 min，主要成分為沉香中廣泛分布的Flidersia型 2-(2-苯乙基)色酮(FTPECs)，莞香系沉香富含較多種類和含量的FTPECs，惠安系次之，星洲系最少。

綜上分析發現，不同產地沉香色酮類成分的組成和含量存在較大差異，顯示出一定地域性：1) 莞香系樣品相似度為0.794～0.939，相似度大于0.8的樣品占比91.67%，匹配得到共有峰最多，且共有峰相對峰面積占所有峰面積比例為43.7%，說明莞香系沉香樣品間差異較小，共有成分數量和相對含量較一致，且色酮種類和數量最為豐富； 2) 星洲系樣品相似度為0.758～0.920，相似度大于0.8的樣品占比75%，匹配得到共有峰較多，共有峰相對峰面積占所有峰面積比例為25.5%，共有成分數量較多而相對含量較低，沉香四醇色譜峰極高，其余化合物色酮數量和相對含量均較低，具有鮮明的地域特征； 3) 惠安系樣品相似度為0.446～0.888，相似度大于0.8的樣品占比31.3%，匹配得到的共有峰數量較少，共有峰相對峰面積占所有峰面積比例為17.0%，說明惠安系沉香色酮種類繁多，組成復雜，THPECs和FTPECs占比較多，個別樣品中具有一種高含量的FTPECs(S13)，DEPECs和EPECs相對含量較低，總體色酮相對含量較莞香系稍低，較星洲系稍高。

分析其原因，莞香系沉香樹種主要為A.sinensis(董夢妤等，2016)，惠安系沉香樹種主要為A.crassna、A.baillonii和A.banaense等(傅婷等，2013)，星洲系沉香樹種主要為A.malaccensis和A.filaria(Liuetal.，2017)，不同樹種之間的基因差異可能是不同產地沉香品質差異的主要原因。同時，地理環境分隔會阻礙不同種源間的擴展和基因交流，即使是同一譜系，地域之間也存在一定基因差異(Zouetal.，2012)。本研究中，莞香系沉香與星洲系沉香之間色酮類成分差異較大，HPLC圖譜差異明顯，可能是由于2個產區地理位置分隔較遠，基因差異相對較大，而惠安系沉香地理位置基本上處于二者中間，HPLC圖譜中，Ⅰ和Ⅳ區色譜峰較莞香系稍少，響應值較高，但Ⅱ和Ⅲ區較星洲系稍多，響應值較低，體現出一定過渡性。此外，沉香品質還強烈依賴于生長地域的地理條件和生態因子，如溫度、光照、水分、土壤和海拔等(Tamulietal.，2005; 朱報著等，2014)，氣溫高、陽光足、降雨量大等外界條件可使沉香結香效果更好(張靜斐等，2017)，莞香系、惠安系到星洲系沉香產地地理環境存在緯度逐漸減小、氣溫逐漸升高、降雨量逐漸增多的趨勢，高溫多雨的氣候條件可能一定程度上會加快植物的新陳代謝，從而影響2-(2-苯乙基)色酮的生物合成過程。

2.3 沉香高效液相色譜產地指紋特征的驗證

不同產地沉香高效液相色譜指紋圖譜差異為沉香產地判別提供了基礎，為了更直觀反映利用HPLC指紋特征對沉香產地判別的可行性，進一步結合多變量統計建立沉香產地判別方法。

PCA利用樣品在主成分得分上的分布可直觀反映出樣品化學成分之間的異同，樣品聚集度高，表明樣品化學成分具有高度相似性，反之，說明存在明顯差異。本研究以36批次沉香85個特征峰的相對峰面積為變量進行主成分分析，色酮類共有峰可用5個主成分刻畫，累計方差貢獻率為62.5%，說明5個主成分對于產地區分的影響力為62.5%。PCA 得分(圖6)顯示，在前2個主成分二維得分視圖平面上，位于左側的莞香系樣品與右側的星洲系樣品可以完全分開，中間的惠安系樣品與其他產地有一定重疊，與產地特征分析結果一致，即莞香系、星洲系內部相似度明顯大于惠安系。

主成分分析對不同產地沉香顯示出一定分類效果，但還無法達到明確區分的目的，因此，本研究進一步采用OPLS-DA建立分類模型，以實現不同產地間的分類和標志性差異化合物的篩選(阿基業，2010)。在全部樣品中隨機抽取30批次樣品作為訓練集建立OPLS-DA模型，另外6批次樣品不參與建模，作為驗證集。模型對訓練集和驗證集樣品的判別正確率均為100%，說明采用36批次來自不同產地沉香的85個特征峰作為產地判別方法的變量是可行的。

利用OPLS-DA建立的判別模型對自變量的擬合指數R2(X)=0.652、對因變量的擬合指數R2(Y)=0.976，表明 65.2%的自變量(共有峰)變化能夠解釋因變量(產地分類)97.6%的差異，模型主成分回歸系數Q2=0.611，大于0.5，表明模型預測能力較強(李遠彬，2017； 皮勝玲等，2017； Gaoetal.，2014)，反映出3個產地間具有明確分離的趨勢(圖7)，與圖譜分析中莞香系沉香與星洲系沉香差異明顯、惠安系沉香在二者之間具有較為明顯的過渡性特征一致。

為了進一步找出對沉香產地分類起貢獻作用的變量，制作OPLS-DA模型的VIP圖(圖8)，VIP代表各變量對模型貢獻率的大小，值越大，貢獻越大。以VIP大于1為界限進行篩選(陳林等，2017； 柯朝甫等，2014； 李永迪等，2017)，有 34個特征峰變量的VIP>1，說明這34個特征峰變量對不同產地沉香樣品分類具有顯著影響(李遠彬，2017)，可作為不同產地沉香的標志性差異化合物(表1)(Lietal.，2016； Liaoetal.，2018； Meietal.，2013； Naef, 2015； Yangetal.，2016； 楊錦玲等，2014； 張倩等，2015)，選取的特征峰變量具有很好的代表性。

圖7 OPLS-DA得分Fig. 7 Score plot in OPLS-DA

圖8 特征峰變量的VIPFig.8 VIP value of the characteristic peak variable

續表1 Continued

3 結論

本研究以36批次來自3個不同產地的沉香為研究對象，通過優化高效液相色譜分離條件進行沉香中2-(2-苯乙基)色酮類化合物的完整分析，建立不同產地沉香高效液相色譜指紋圖譜。不同產地沉香因樹種、地理位置和生態環境等的共同影響，2-(2-苯乙基)色酮類化合物顯示出一定地域性，具有獨特的高效液相色譜指紋特征。利用HPLC圖譜指紋特征結合OPLS-DA，可實現對莞香系、惠安系和星洲系3個不同產地沉香的判別。