以玉米為例探究單子葉植物重力響應及維管結構的變化*

賀學嬌 楚立威 文爽爽 盧孟柱,2,3 唐 芳,3

(1.中國林業科學研究院林業研究所 林木遺傳育種國家重點實驗室 國家林業和草原局林木培育重點實驗室 北京 100091；2.浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300；3.南京林業大學 南方現代林業協同創新中心 南京 210037)

環境條件對植物生長發育有著重要的影響，當外界條件(光照、濕度、溫度、重力等)改變時，植物會快速感知并通過調節自身生長狀態來適應新的環境。在這些環境因素中，重力因其發揮作用較為穩定且持續存在，對植物的生長發育、形態建成、生理代謝等生物學過程發揮著巨大的作用(Volkmannetal., 2006)。不同的植物類群及植物器官已經具備完整的進化機制，能夠調節與重力作用相關的生長和定向變化(Gerttulaetal., 2015)。人們將植物能夠根據重力的作用方向來調節自身生長方向的能力稱為向重力性。目前植物對于重力作用的反應過程大致分為4個階段：對重力信號的感受、對重力信號的轉導、調節生長素進行不對稱分布以及反應器官彎曲生長(Strohmetal., 2012)。

研究表明，當改變樹木正常垂直生長的方向時，會誘導形成彎曲或傾斜的樹干，樹木在調整恢復枝干的垂直生長方向或維持樹枝的自然角度方向時，由于形成層在莖干一側的活動增加，導致莖干發生不對稱生長，從而使構成次生木質部的各種細胞比例及次生壁超微結構發生一定改變(Ruelle, 2014)，形成在化學組成及物理力學性質等方面明顯不同的木材，這種特殊的木材組織就是應力木 (reaction wood)(Fournieretal., 2014)。在形成層的作用下，應力木通常只出現在枝干或枝條的一側。在裸子植物中主要形成于莖或枝的近地側，稱為應壓木(compression wood)(Ruelle, 2014)； 在被子植物中，則主要位于莖或枝的遠地側，稱為應拉木(tension wood)(Mellerowiczetal., 2012)。相對于應力木，枝干另一側形成的對立木(opposite wood)沒有明顯的特征變化。

不同于雙子葉植物具有連續的形成層組織能夠不斷進行木質部的分化(木材形成)，單子葉植物的維管束是散生的且大多沒有形成層，其禾本科(Gramineae)植物莖的生長主要依靠節間基部的居間分生組織自下而上進行分裂活動(劉江偉等，2014)。當重力條件改變時，單子葉植物會感受重力刺激發生向性生長，反應部位兩側生長素會發生不對稱分布，導致兩側細胞差異生長，最終造成一定方向上的彎曲(Perrinetal., 2005)。但是目前單子葉植物在響應重力刺激發生植株彎曲生長過程中產生的結構變化還不是很清楚，特別是重力誘導后其維管組織有什么變化，與木本植物的應力木有什么區別，是值得研究的問題。另外，竹子(Bambusoideae)與玉米(Zeamays)都屬于單子葉植物，通過對玉米重力誘導，將有利于了解單子葉植物在重力誘導下的維管組織特性，對于竹子等單子葉植物重力響應的研究具有重要的意義。玉米作為典型的單子葉禾本科植物，已經完成了全基因組的測序(Weietal., 2009)，并且具有易栽培、生長快，莖稈堅硬、直立等特點，適合進行重力響應研究。本文對玉米在重力響應過程中發生的形態變化、組織結構變化及細胞壁成分變化進行了研究分析，確定了其維管組織的變化特征。研究結果不僅為了解單子葉植物對重力作用的反應機制提供了依據，也將有利于對裸子植物、雙子葉植物和單子葉植物重力響應的異同點進行分析，為進一步研究單子葉植物如竹類及其他林木的重力響應機制提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本文中的所有試驗材料均為玉米B73自交系，種子由中國農業大學農學與生物技術學院提供。先將營養土和蛭石按照1∶1體積比混合后裝入口徑約20 cm的培養缽中，之后把種子直接點播在土里。播種后的玉米先于人工氣候室(溫度24～25 ℃，光照/黑暗14 h/10 h)培養至2葉期，再將其轉移至溫室繼續培養(培養溫度大約在25～30 ℃，光照/黑暗14 h/10 h)，待玉米幼苗發育至10葉期后進行重力試驗處理。玉米幼苗種植和重力試驗于2019年4—8月間重復進行5次。

1.2 試驗方法

1.2.1 重力響應試驗 將10葉期的玉米苗直接水平放倒(圖1)，并調整莖稈位置使其對生葉片自然均勻分布于莖稈兩側，植株與地面平行，對照植株保持直立生長。每次試驗設置同期同狀態的3～4株玉米進行重力響應處理，另外3～4株作為對照。試驗組和對照組植株都在相同的環境條件下生長，并保證植株土壤有足夠的水分。使用Wingscapes timelapsecam相機(WINGSCAPES，美國)對放倒的植株進行連續拍照，時間間隔設定為每張10 min，記錄玉米在重力響應過程中的表型變化。重力響應試驗先后重復5次。

1.2.2 材料獲得及組織切片 當處理的玉米植株到重力響應的終止狀態后，將莖節處著生的葉片剝離，使莖稈上各莖節裸露出來。對發生形態變化的玉米莖節和部位進行表型觀察和拍照記錄，并做組織切片分析，取樣部位在莖節上下各1.5 cm處。對照植株也截取相對應的部位進行切片。

對上述選取的材料分別進行橫切和縱切。由于發生形態變化的玉米莖節在近地側部分發生膨大和彎曲變化，而遠地側無明顯變化，故以橫截面上近地側與遠地側的中間位置為切入點將樣品一分為二。一份進行縱切，以便獲得莖節在縱切面上的形態變化； 另一份進行連續的橫向切片，從中明確表型變化最明顯的部位。之后對該部位進行莖段的完整橫切，從而觀察莖節在橫切面的結構變化。上述所有組織切片均使用LEICA VT100 S振蕩切片機(Leica，德國)進行快速振蕩切片，其中縱切厚度為80 μm，橫切厚度為70 μm。

1.2.3 運用不同染色方法對組織結構進行觀察 甲苯胺藍(簡稱TBO)為堿性染料，組織中的酸性物質能與TBO染料中的陽離子相結合而被染色。植物細胞中，栓質化組織、木質化細胞壁染色呈現藍綠色； 非木質化(如多糖類性質)細胞壁呈現紅紫色； 蛋白質以及含蛋白質混合物則被染為藍色或藍紫色(張仲鳴等，1997)。0.05% TBO染色時間約為30 s，沖洗3次后進行觀察。

間苯三酚可以在酸性環境下與細胞壁中的木質素特異結合發生櫻桃紅或者紫紅色反應，是植物顯微化學中確定木質化細胞壁的最常用和最簡單的方法。將3% 間苯三酚溶液與37% 濃鹽酸按照2∶1體積混勻成間苯三酚-HCl溶液進行染色。染色時間約為1 min，沖洗3次后進行觀察。

Calcofluor White(簡稱CFW)染料是一種熒光增白劑，與多種植物及真菌細胞壁的纖維素有很強的親和力，表達出很強的亮藍色熒光。本試驗直接使用Calcofluor White染色液成品(Sigma，#18909)滴染樣品，染色時間為1 min，沖洗3次后進行觀察。

染色后的組織切片均在Olympus BX51顯微鏡(Olympus，日本)下觀察并拍照記錄。其中，TBO、間苯三酚-HCl染色的切片只需在明場下觀察，而Calcofluor White染色切片則需在紫外光(330～400 nm)下進行。因玉米樣本面積過大，需使用CellSens標準軟件在10倍物鏡下進行圖像拼接才得到完整圖像。

2 結果與分析

2.1 玉米響應重力的形態變化過程

當重力條件改變以后，玉米會迅速感應重力信號，植株形態也隨之發生變化。重力處理的玉米延時拍攝顯示，玉米植株響應重力作用后發生了明顯的動態變化(圖1)。從玉米植株水平放置后的0 h到第5 h，植株形態基本沒有發生變化(圖1A、B)； 到第10 h，植株頂端響應重力條件的改變而向上彎曲翹起(圖1C)； 之后玉米植株快速持續地向上彎起，直至第94 h植株形態不再發生明顯變化，向上彎起的莖稈保持與水平面垂直的狀態繼續生長(圖1D-F)。

圖1 玉米植株重力響應過程中不同時間點的形態Fig. 1 Morphology of maize plants at different time during gravity response processA: 0 h; B: 5 h; C: 10 h; D: 20 h; E: 30 h; F: 94 h, 重力響應的終止狀態 The permanent status of maize plant response to gravity.

為了便于對多次重復的重力試驗進行數據統計，以第1片旗葉著生的節作為第1莖節，從下往上依次標記莖節。統計結果(表1)表明，第1、2、3莖節在多次試驗中均未發生形態的變化，而植株頂端在水平放置后的第8～10 h左右響應重力作用開始翹起； 隨后大約2 h后，第6莖節響應重力開始向上彎起； 約10 h后，第5莖節響應重力并向上彎曲生長； 再過大約10 h，第4莖節也開始向上彎曲生長。此后直至玉米植株重力響應的終止狀態，第4、5、6莖節持續保持彎曲生長，使得玉米植株與水平面的夾角逐漸增大，直至最終呈90度角，玉米頂端恢復直立生長狀態。

表1 玉米不同莖節響應重力的時間節點統計Tab.1 The statistics of time that different stem nodes response to gravity in maize

剝離玉米植株葉鞘處著生的葉片后可以看到，只有第4、5、6莖節靠近節的位置發生了明顯的彎曲生長，近地側部位出現了不同程度的膨大變化(圖2)，從而使這3個莖節在近地側和遠地側發生不對稱生長。相比之下，直立放置的玉米對照植株相對應的莖節部位并未出現形態的改變。

圖2 玉米植株第4、5和6莖節的外觀形態Fig. 2 Morphology of the fourth, fifth and sixth stem nodes of maize plantsA-C: 直立生長的對照植株莖節部位； D-F: 重力響應植株的莖節部位。A, D：第6莖節； B, E：第5莖節； C, F：第4莖節。比例尺：5 mm。A-C: The stem nodes of the control plants growing vertically; D-F: The stem nodes of the plants response to gravity. A, D: The sixth stem node; B, E: The fifth stem node; C, F: The fourth stem node. Scale bar: 5 mm.

2.2 玉米不同莖節響應重力作用后的顯微結構變化

對玉米第4、5、6莖節的縱切切片進行結構觀察，發現不同莖節之間結構變化趨勢基本一致。由圖3縱切結果可知，對照組莖節兩側生長狀態基本一致，導管系統均勻地直立分布； 而響應重力改變的玉米莖節發生了形態結構的變化，近地側向上彎曲生長，遠地側只發生輕微彎曲，同時莖節內部的維管組織也相應地發生結構變化并呈現彎曲分布的狀態。

圖3 玉米植株第5莖節的縱切顯微結構Fig. 3 Longitudinal microstructure of the fifth stem node of maize plantsA: 直立生長的對照植株; B: 重力響應植株。A: The control plants growing vertically; B: The plants response to gravity.

在前期試驗結果基礎上，選取不同莖節變化最為明顯的部位進行完整的橫切切片，TBO染色后進行結構對比觀察。由圖4可知，玉米在直立生長狀態下，第4、5、6莖節的橫切面呈圓形，維管束結構、大小近乎一致而且均勻地分布(圖4A-C)。在重力條件改變后，玉米莖節近地側發生膨大，從橫切可以看出，第4、5、6莖節近地側膨大部位的維管束均較對照植株大，呈現為紡錘形且沒有明顯的導管組織(圖4D、E、F)，維管束細胞數量顯著增多、細胞壁極顯著變薄(圖5)。而3個莖節遠地側最外層維管束與對照相比變化不一，其中第4莖節的維管束面積增大、細胞數量明顯增多，細胞壁顯著增厚； 第5莖節的維管束細胞數量與對照無明顯差異，細胞壁顯著變薄； 第6莖節維管束的細胞數量增多，細胞壁也顯著變薄。由此看出，受重力作用后的3個莖節，由于生長發育狀態的不一致，響應重力的作用不同，其結構變化也有所差異，其中第4莖節近地側和遠地側的維管束變化最為顯著。

圖4 玉米第4、5、6莖節的顯微結構變化Fig. 4 The anatomical change of the fourth, fifth and sixth stem nodes of maize plants莖節橫切面TBO染色結果。A-C: 直立生長的對照植株； D-F:重力響應植株。A, D: 第4莖節; B, E: 第5莖節; C, F: 第6莖節。每個完整圖右側的4個圖是對應部位(紅框)維管束的放大圖；40×比例尺為50 μm，100×為20 μm。TBO stained cross sections. A-C: The control plants growing vertically; D-F: The plants response to gravity. A, D: The fourth stem node; B, E: The fifth stem node; C, F: The sixth stem node. The four pictures on the right side of each complete picture are magnified pictures corresponding to the labeled area with red rectangle, respectively. The scale of 40× is 50 μm, and 100× is 20 μm.

圖5 玉米對照植株和重力響應植株第4、5、6莖節的維管束細胞數量和細胞壁厚度Fig. 5 The cell number and cell wall thickness of vascular bundles in the fourth, fifth and sixth stem nodes between maize control plants and gravity response plantsCK: 對照; D-d: 重力-遠地側; D-p: 重力-近地側。CK: Control； D-d: Gravity-distal； D-p: Gravity-proximal. **: P<0.01.

2.3 重力誘導后細胞壁成分變化

根據TBO染色結果可以看出遠、近地側維管束細胞壁厚度的差異及著色不同，推測2個部位的細胞壁成分如木質素、纖維素等的含量也可能存在差異。因此，使用木質素和纖維素特異染料對重力響應植株和對照植株的莖節橫切切片進行染色和比較(圖6)。

圖6 玉米第4、5、6莖節的木質素含量變化Fig. 6 The lignin content change of the fourth, fifth and sixth stem nodes of maize plants莖節橫切面HCl-間苯三酚染色結果。A-C: 直立生長的對照植株； D-F: 重力響應植株。A, D: 第4莖節; B, E: 第5莖節; C, F: 第6莖節。每個完整圖右側的4個圖是對應部位(紅框)維管束的放大圖； 40×比例尺為50 μm，100×為20 μm。HCl-phloroglucinol stained cross sections. A-C: The control plants growing vertically; D-F: The plants response to gravity. A,D: The fourth stem node; B,E: The fifth stem node; C,F: The sixth stem node. The four pictures on the right side of each complete picture are magnified pictures corresponding to the labeled area with red rectangle, respectively. The scale of 40× is 50 μm, and 100× is 20 μm.

由圖6染色結果可以看出，玉米對照植株莖節內的維管束都能被間苯三酚染色，其中導管部位被染成桃紅色。重力響應植株的莖節中，遠地側的維管束也能被間苯三酚染色，但近地側的維管束著色較淺，導管部位呈現微弱的紅色。說明近地側維管束的細胞壁中木質素含量低于對照，而遠地側維管束細胞壁中木質素含量與對照相比沒有明顯變化。

同時，縱向比較不同莖節染色結果也可以看出，位于植株下方位置的第4莖節比第5、6莖節染色程度更深，說明3個莖節之間因發育程度的差異也會造成維管束木質素含量的差異。

通過CFW染色，可以分析細胞壁中纖維素的變化。以第4莖節染色結果為例(圖7)，對照組玉米莖節靠近表皮的維管束中，木質部和韌皮部位置均能被CFW染色并在紫外下呈現亮藍色，而維管束鞘部位著色極淺，在紫外下只有微弱的藍色可見。在重力作用后的莖節中，遠地側的維管束和對照植株維管束染色結果一致，維管束鞘細胞壁也只呈現微弱的藍色； 而近地側膨大部位的維管束幾乎都能被染色而呈亮藍色。這個結果與間苯三酚染色結果相對應：在遠地側表皮維管束中，維管束鞘部位能被間苯三酚染色，但CFW染色較淺； 而近地側膨大部位的維管束間苯三酚染色較淺，但能被CFW染色并呈亮藍色。說明近地側維管束的細胞壁成分與對照維管束細胞壁成分有較大差別，即近地側維管束中細胞壁的纖維素含量較高，而木質素較低。這可能是由于受到重力作用后，近地側維管束的細胞數量增多，細胞壁發生了重構，新生的細胞壁多為未次生加厚的初生細胞壁。

綜上所述，玉米在感應重力條件改變后，會迅速調整莖節延伸的方向，在莖節近地側出現明顯的組織膨大。與對照維管束相比，近地側維管束的細胞數量增多，細胞壁厚度顯著變薄，木質素含量降低，纖維素含量增加； 遠地側維管束的結構和細胞壁成分沒有明顯的變化，但細胞數量和細胞壁厚度發生了一定改變。

圖7 玉米第4莖節的纖維素含量變化Fig. 7 The cellulose content change of the fourth stem nodes of maize plants莖節橫切面Calcofluor White染色結果。A：直立生長的對照植株； B：重力響應植株。每個完整圖右側的小圖是對應部位(紅框)維管束的放大圖(40×)； 40×比例尺為50 μm。Calcofluor White stained cross sections. A: The control plants growing vertically; B: The plants response to gravity. The small pictures on the right side of each complete picture are magnified (40×) pictures corresponding to the labeled area with red rectangle, respectively. The scale of 40× is 50 μm.

3 討論

重力對植物的生長發育、形態建成、生理代謝等生物學過程發揮著重大作用，特別是對植物自身生長方向的變化起到關鍵作用(Volkmannetal., 2006)。在以楊樹(Populus)和松樹(Pinus)為代表的雙子葉植物和裸子植物中，對重力響應的反應和機制開展了大量的研究。當重力條件改變時，楊樹會被誘導形成彎曲或傾斜的樹干，在遠地側形成應拉木，近地側形成對立木。由于應拉木側的形成層活動增加，最終形成偏心生長的年輪； 應拉木的導管減少，纖維細胞增多(Zinkgrafetal., 2018)。細胞壁中含有由大量膠質纖維和部分非纖維素、多糖組成的膠質層(G-layer)，并完全取代了正常木材次生壁的S3層甚至是S2層 (Decouetal., 2020; Gritschetal., 2015)，膠質層缺少半纖維素和木質素，使得木材的木質化程度降低(Pilateetal., 2004)。與正常木材相比，應拉木中木質素、半纖維素含量顯著降低，纖維素含量較高(Pramodetal., 2013)。而裸子植物形成的應壓木特點與雙子葉植物的應拉木特點相反，應壓木通常在彎曲或傾斜的樹干近地側形成較大的生長環(Groover, 2016)。應壓木的次生壁沒有S3層，S2層增厚(Donaldsonetal., 1999)。大部分木質素集中在S2層，致使木質素含量增高，而纖維素含量減少。木質素含量的增高使得應壓木的木材密度增大并且表現出更強的抗壓性(Westing, 1965)。

在本研究中，玉米受到重力作用以后，莖節近地側發生膨大。從橫切面可以看出，近地側部位的維管束細胞數目增多且呈現為紡錘形，而遠地側維管束的結構、大小和細胞壁厚度因生長狀態的不同，與對照相比有不一樣的變化。可以推測，玉米在響應重力過程中也會發生類似于裸子植物重力響應的偏心生長，即應力木是在彎曲莖干的近地側，對立木在遠地側。此外，對照植株維管束鞘的細胞壁增厚，木質素含量較高； 而近地側膨大部位維管束的細胞壁比對照植株維管束細胞壁薄，木質素含量較少，纖維素含量增加。這些特點又與雙子葉植物的應拉木相似(Pramodetal., 2013)，都具有纖維素含量高、木質素含量低等特點。綜上可以看出，玉米對重力的反應及響應過程可能綜合了裸子植物和雙子葉植物重力響應的一部分特點，在近地側形成類似于應力木的結構，但其維管束的木質素含量較低，纖維素含量增高。

玉米沒有連續的分生組織結構，玉米莖稈的節和節間在拔苗期已分化形成，節間的伸長主要依靠居間分生組織完成(季青等，2004)。因此，當重力條件改變后，玉米不能像楊樹或松樹一樣依靠自生的形成層系統進行持續的細胞分化和次生生長，發生偏心生長，并通過次生細胞壁結構和成分的改變來產生適應重力條件改變的形態。玉米是通過莖稈的不同莖節來感應重力，從頂端向下依次向上彎起，但并不是所有的節間都會發生形態的變化，比如，本研究中的玉米均處于10葉期，只有在中部靠下的第4、5、6莖節會出現明顯的組織膨大。通過顯微結構分析，可以看出，雖然沒有樹木的形成層，重力誘導下玉米居間分生組織活動所產生的維管組織(維管束)在近地側產生了與應拉木相似的特性變化，其特征變化的部位與裸子植物的壓縮木類似，都是在近地側位置。因此，玉米感應重力響應具有自己的特征，這為研究植物重力響應提供了新的研究材料和途徑。在木材形成的研究中，木質部的分化調控研究大都是以擬南芥(Arabidopsisthaliana)突變體作為研究材料，而管狀分子分化研究則是利用百日草(Zinniaelegans)葉肉細胞體外培養誘導系統，這些研究成果構建了木材形成的基本基因調控網絡。玉米作為單子葉植物，其居間分生組織與雙子葉木本植物形成層的分生組織類型顯著不同，可用來觀察在重力誘導下不同分生組織對維管系統分化(木材形成)的不同影響。試驗結果也證明單子葉禾本科分生組織對于重力的反應有其特有的特點，但重力作用下維管組織的分化確實出現了類似楊樹應力木的導管少、細胞壁木質素少等特性。通過比較不同分生組織在重力下對維管組織的影響及相應的基因表達，可以為理解維管組織分化(木材形成)的調控機制，為木材形成的研究探索新的研究途徑。

此外，有研究通過比較單子葉植物[絲蘭(Yucca)和朱蕉(Cordyline)]的形成層及其早期衍生組織與雙子葉植物[楊樹和桉樹(Eucalyptus)]維管形成層和次生木質部組織的轉錄組數據，發現單子葉形成層和維管形成層的調控存在著廣泛的重疊。在表達基因中，單子葉形成層和維管形成層樣本中有80%以上的基因本體注釋(GO terms)相同(Zinkgrafetal., 2017)。因此單子葉植物重力響應的研究對理解木本植物不同的重力響應機制具有一定的參考價值。此外，玉米重力響應表型變化既包含裸子植物的一部分特征，又具有雙子葉木本植物的一部分特征，且其主要變化發生在維管組織，因此對玉米重力響應的研究對于林木木材形成特別是單子葉植物如竹子的竹材遺傳調控具有一定的借鑒意義。

4 結論

本研究通過分析玉米重力響應的過程、結構特征及成分變化，發現單子葉禾本科植物玉米在重力響應機制上既包含了與裸子植物應壓木和雙子葉植物應拉木相似的特征變化，又與二者有所區別，這為進一步研究重力響應下維管組織分化調控及其進化機制奠定了基礎。