門源縣越冬成功的3種紫花苜蓿抗寒性研究

李 倩， 李長慧*， 孫啟忠， 王有良

(1.青海大學農牧學院， 青海 西寧 810016； 2.中國農科院草原所， 內蒙古 呼和浩特 010010；3.門源縣草原站， 青海 海北 810399)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培最早、種植面積最大、經濟價值最高的多年生豆科牧草，被稱為“牧草之王”。國內北方地區海拔及氣候條件導致苜蓿不能越冬，制約了苜蓿產品發展。目前，國內外許多專家對苜蓿抗寒性生理生化指標研究發現。苜蓿根中可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量與溫度成反比[1]，有研究表明苜蓿在低溫條件下通過提高超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性，清除苜蓿體內活性氧自由基，減少對苜蓿的損傷，使苜蓿抵抗凍害[2]。王瑞云[3]研究發現膜脂過氧化的產物丙二醛含量會大量積累，不同苜蓿品種丙二醛的生成量存在差異，抗寒性強的品種丙二醛積累量少。目前關于青海省苜蓿抗寒性方面的研究很少，對苜蓿全年四季抗寒性比較的研究也較少。本試驗旨在研究門源縣在高海拔環境下越冬成功的3種紫花苜蓿在不同采樣時期生理生化指標變化規律，探討苜蓿抗寒生理，為門源縣篩選出抗寒性最強的苜蓿品種，對高寒地區苜蓿抗寒性研究和引種均有積極的促進作用。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

本試驗試驗區位于門源回族自治縣(37°61.780′ N，101°32.313′ E)，屬于高原大陸性氣候，地處中緯度西風帶區，海拔2 960 m，最高溫度27.5℃(8月)，最低溫度—26.4℃(1月)，年均溫0.8℃，年均降水量約520 mm。

1.2 研究材料

中國農科院草原所于2017年5月從國內外收集了17個紫花苜蓿品種在門源縣引種試驗，紫花苜蓿播量22.5 kg·hm-2,行間距12.5 cm,每種苜蓿16行。經過越冬2018年只有‘中蒙1號’(M.sativa‘Zhongmeng No.1’)，‘赤雜1號’(M.sativa‘Chiza No.1’)，‘公農1號’(M.sativa‘Gongnong No.1’)等3種苜蓿順利越冬，且農藝性狀良好，3種紫花苜蓿的越冬率分別為92.3%，84.6%，78.6%。

1.3 研究方法

將2017年種植的已越冬的3種紫花苜蓿分別于越冬前、最低溫期、越冬返青后、生長旺盛期采樣取根。將紫花苜蓿根部用自來水沖洗干凈，并用濾紙吸干根系上的水分以鮮樣測定可溶性蛋白(soluble protein，SP)、游離脯氨酸(free proline，Pro)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、過氧化物酶(peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性。SP含量用考馬斯亮藍G-250染色法測定[4]；MDA含量用硫代巴比妥酸法測定[4]；Pro含量用磺基水楊酸法測定[4]；SOD活性的測定用NBT光化還原法測定[5]；POD活性的測定用愈創木酚法測定[5]；CAT活性的測定用紫外吸收法測定[5]。

利用模糊數學中隸屬函數法[6-7]對多個生理生化指標綜合評價。首先對3種紫花苜蓿各個生理指標標準化處理，對SP，Pro，POD，SOD，CAT等指標用公式(1)，MDA指標用公式(2)，求得各指標的隸屬函數值。再求各指標的標準差系數、權重，最后得出3種紫花苜蓿的綜合評價D值。公式中，Fij為j指標隸屬值；Xij為j指標標準化值；Xjmin為j指標標準化后的最小值；Xjmax為j指標標準化后的最大值。

(1)

(2)

1.4 數據處理

用Microsoft Excel 2010數據錄入、數據處理以及圖表制作，表中所列數據均用平均值±標準差表示，用SPSS 20.0分別對3種苜蓿、4個時期用Duncan法單變量方差分析。

2 結果與分析

2.1 可溶性蛋白含量

‘公農1號’SP含量(表1)顯著低于‘中蒙1號’和‘赤雜1號’(P<0.05)，4個時期間差異顯著(P<0.05)。3種苜蓿SP含量在1月達到頂峰，隨著返青期溫度回升，SP含量持續下降。

表1 不同時期、不同品種可溶性蛋白含量變化Table 1 Changes in soluble protein content in different periods and varieties/mg·g-1

2.2 游離脯氨酸含量

‘中蒙1號’和‘公農1號’Pro含量(表2)顯著高于‘赤雜1號’(P<0.05)，1月和4月Pro含量顯著高于10月、8月(P<0.05)，10月—1月3種苜蓿Pro含量隨溫度降低而增加，4月返青期溫度升高，Pro含量減少。

表2 不同時期、不同品種游離脯氨酸含量變化Table 2 Changes in free proline content in different periods and varieties/mg·g-1

2.3 過氧化物酶活性

‘中蒙1號’，‘赤雜1號’，‘公農1號’POD活性(表3)差異顯著(P<0.05)，4個時期間差異顯著(P<0.05)。10月—次年1月POD活性隨著溫度的降低而增加，1月—8月隨著溫度的升高POD活性逐漸減少。

表3 不同時期、不同品種過氧化物酶活性變化Table 3 Changes in peroxidase activity in different periods and varieties/μ·g-1·min-1

2.4 超氧化物歧化酶活性

SOD活性(表4)‘中蒙1號’顯著高于‘公農1號’(P<0.05)，1月SOD活性顯著高于4月、10月、8月(P<0.05)。10月—次年8月間隨溫度的下降3種苜蓿SOD活性增加，溫度上升SOD活性減少。

表4 不同時期、不同品種超氧化物歧化酶活性變化Table 4 Changes in superoxide dismutase activity in different periods and varieties/μ·g-1·min-1

2.5 過氧化氫酶活性

‘中蒙1號’，‘赤雜1號’，‘公農1號’CAT活性(表5)差異顯著(P<0.05)，1月CAT活性顯著高于10月、4月、8月(P<0.05)。10月—次年1月隨著溫度的不斷下降3種苜蓿CAT活性逐漸增加，隨著溫度的升高CAT活性減少。

表5 不同時期、不同品種過氧化氫酶活性變化Table 5 Changes in catalase activity in different periods and varieties/μ·g-1·min-1

2.6 丙二醛含量

‘中蒙1號’，‘赤雜1號’，‘公農1號’MDA含量(表6)差異顯著(P<0.05)，8月MDA含量顯著高于1月(P<0.05)。隨著溫度的降低MDA含量下降，溫度上升MDA含量隨之增加。

表6 不同時期、不同品種丙二醛含量變化Table 6 Changes in malondialdehyde content in different periods and varieties/μmol·g-1

2.7 門源縣不同品種抗寒性綜合評價

采用模糊數學隸屬函數值法，將每個品種的4個時期SP，Pro，POD，SOD，CAT，MDA值做標準化處理并平均，根據隸屬函數值與權重得出綜合評分值D，D值越高，品種抗寒性越強，反之越弱。因此，抗寒性強弱為‘中蒙1號’>‘赤雜1號’>‘公農1號’(表7)。

表7 不同品種抗寒性綜合評價Table 7 Evaluation of cold resistance of different varieties

3 討論

張仲鵑[8]研究全年不同時期苜蓿SP，Pro，MDA含量發現，SP，Pro含量與溫度呈負相關關系，MDA含量與溫度呈正相關關系。馬維文[9]研究越冬期白三葉生理指標發現，SP，Pro，POD，SOD，CAT與溫度成負相關關系，MDA含量與溫度呈正相關關系。朱愛民[10]對降霜前后的苜蓿研究結果表明POD，SOD，CAT活性，Pro含量在低溫過后顯著增加，MDA含量顯著降低,但張海燕[11]通過對歐美楊(Populus×euramericana)無性系低溫處理發現SP，MDA含量，POD，SOD，CAT活性都隨溫度的降低先增加后降低。本試驗中3種紫花苜蓿SP，Pro含量，POD，SOD，CAT活性與溫度呈負相關，與張仲鵑[8]、馬維文[9]、朱愛民[10]研究結果相同，與張海燕[11]對POD，SOD，CAT的研究結果不同可能是因為本試驗最低溫是-25.6℃，而張海燕試驗中最低溫是-35.0℃，超出本試驗范圍。本試驗中MDA含量與溫度呈正相關，與張仲鵑[8]、朱愛民[10]等人對MDA的研究結果一致。

4 結論

門源縣3種紫花苜蓿SP，Pro含量與POD，SOD，CAT活性與溫度呈負相關關系，MDA含量與溫度呈正相關關系。從不同月份來看，3種紫花苜蓿除MDA外其余指標含量(活性)均為1月最高。應用模糊數學中隸屬函數值和權重對門源縣3種紫花苜蓿的生理生化指標進行抗寒性綜合評價，‘中蒙1號’苜蓿品種抗寒性最強。