苜蓿多葉品系BC2群體農藝性狀改良效果研究

吳嘉龍， 魏臻武， Omer Idris Olom

(揚州大學動物科學與技術學院/揚州大學草業科學研究所， 江蘇 揚州 225009)

苜蓿(MedicagosativaL.)常見葉片形態為三出羽狀復葉，當其葉柄上著生小葉數在3片以上時，則稱之為多葉苜蓿。多葉苜蓿具有葉量大、蛋白含量高、消化率高、品質好等特點，是提高飼料蛋白的優良品種類型，雖然多葉苜蓿具有良好的品質性狀，但其生長性能會有所降低，多葉苜蓿群體內不同株系的生產性能不盡相同，因此通過培育多葉苜蓿群體選育優良單株，培育高產型多葉苜蓿具有十分重要的意義[1-3]。苜蓿的多葉性狀從發現至今已有80年歷史，早在20世紀40年代，Mokeyeva[4]報道了苜蓿在春秋季有多葉型葉片的出現，而后Hart[5]、Bingham[6]、Etzel[7]等對苜蓿的多葉性狀進行了更深入的研究。我國多葉苜蓿的選育工作最早由崔璐[8]、于林清[9]等展開，研究表明多葉苜蓿材料存在遺傳不穩定、多葉率差異較大的問題，因此培育能夠穩定遺傳、綜合性狀優良的多葉型苜蓿新品種具有重要意義。近年來，國內學者對苜蓿的多葉性狀進行了研究，也有不少通過雜交、自交等方式構建了多葉苜蓿群體。朱平華[10]構建了多葉型與三葉型苜蓿雜交F1代，并對其遺傳關系進行了研究發現F1代可劃分為5個類群，植株差異較大。唐嘉等[11]通過自交構建多葉苜蓿S2群體，發現群體中性狀表現差異較大，生長速率變緩且株高差異變大。

回交是將兩個親本雜交后，將雜交后代與親本之一進行雜交的一種育種方法，在玉米、小麥等作物上已有較多運用[12-14]。回交通常以綜合性狀優良的品種作為輪回親本，而具有目標性狀的品種作為非輪回親本，后代雜種中可獲得兼具親本優良基因的優良品種[15]。目前，我國國產苜蓿與國外仍有一定差距[16]，已育成多葉苜蓿品種少有報道，通過回交的方法構建苜蓿群體，對紫花苜蓿新品種選育及綜合苜蓿高產與高質量的相關性狀具有重要的研究意義。本研究將南澳品系多葉苜蓿‘PL34HQ’作為非輪回親本，‘淮陰苜蓿’為輪回親本構建BC2(回交二代)群體，通過對200株BC2群體材料的農藝性狀進行相關性、主成分及聚類分析，旨在探究回交群體各性狀的田間表現，研究多葉苜蓿回交群體的多代回交育種策略在群體改良以及單株選育的效果，以期選育出多葉表現穩定且性狀優良的苜蓿新品種，對高產、高質量的優質紫花苜蓿的品種選育具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以多葉苜蓿‘PL34HQ’為非輪回親本，3葉苜蓿‘淮陰苜蓿’為輪回親本的回交BC2群體為研究材料。非輪回親本為南澳品系，多葉性狀穩定，多葉率高達86%，株型斜生，分枝數較少。輪回親本是我國江淮地區的苜蓿類型，莖直立，株高高、分枝數多，綜合性狀好。

1.2 群體種植

田間試驗在揚州大學揚子津校區牧草試驗地(東經119°36′，北緯32°43′)采用筒植技術種植，于2016,2017,2018年分別獲得F1，BC1，BC2群體，同年10月在田間PVC桶中種植，桶直徑16.5 cm，間距1.2 m，覆土深度一致。全生長階段不施肥、不灌溉，使群體自然生長。

1.3 試驗方法

1.3.1測定指標 株高、單株多葉率(苜蓿多葉單株中含多葉的枝條數占總枝條數的百分比)、主枝多葉率(苜蓿多葉單株主枝上多葉葉片數占主枝總葉片數的百分比)參照魏臻武、楊艷婷[17]的方法進行測定。莖粗、節間數、莖葉比采用韓清芳[2]的方法進行測定。分枝數采用于林清、王運濤[18]的方法進行測定。參照Humphries[19]的方法測定主枝長度和側枝長度，主枝長度/節間數即節間長度。均選取苜蓿的5個主枝進行測定。

1.3.2數據分析 用Microsoft Excel 2016進行數據整理，用SPSS 24.0進行相關性、主成分分析分析，采用R語言進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 BC2田間指標相關性分析

由相關性分析結果(表1)可知，苜蓿的株高、分枝數、多葉率、莖粗、節間數、側枝長度等性狀之間存在不同程度的相關性。株高與側枝長度顯著正相關(P<0.05)，與分枝數、莖葉比、莖粗、節間長度節間數極顯著正相關(P<0.01)，表明在回交群體的改良過程中，株高性狀的提高有利于改善與產量相關的性狀，獲得更高的生物學產量，但隨著株高的提升，苜蓿莖葉比也會隨之增加，株高與多葉率負相關但不顯著，表明兩者之間沒有明顯的相關性，具有改良潛力。主枝與單株多葉率極顯著正相關(P<0.01)，表明苜蓿的多葉性狀在群體中能夠很好的表達。

莖葉比與節間數顯著負相關(P<0.05)，與株高、節間長度、莖粗等極顯著極顯著正相關(P<0.01)，與主枝多葉率、側枝長度顯著負相關(P<0.05)，表明多葉性狀和苜蓿的二級分枝能改善苜蓿的莖葉比。

2.2 BC2主要性狀頻數分布

由圖1可知，經2次回交后，群體中單株的分枝數、株高、株型、側枝長度等性狀均偏向于輪回親本，特別是株高和側枝長度，改良效果明顯。BC2群體多葉率為25.5%，其中主枝多葉率50%以下38株，占多葉株數的74.5%。經2代回交后群體中主枝多葉率表現出下降趨勢，但仍有13株主枝多葉率在50%以上，占多葉單株的25.6%，其中多葉率極高，主枝多葉率70%～90%的5株，保留了多葉親本的高多葉率特性。

表1 苜蓿回交二代群體9個農藝性狀相關性分析Table 1 Correlation analysis of 9 agronomic traits of population in the second backcrossing generation of alfalfa

在BC2群體中，苜蓿直立型莖占群體的77.5%；表現出二級分枝性狀的苜蓿占群體的75%，優于輪回親本的占8.5%；莖粗主要集中在1.8～3.6 cm，占群體的80.5%；莖葉比低于非輪回親本的占群體10%；株高較非輪回親本有了很大程度的提高，株高主要集中在60～80 cm，占群體65.5%，株高大于輪回親本的20株占群體10%，分枝數主要集中于9～17之間，占群體的71.5%，優于輪回親本的占9.5%。

2.3 回交親本及BC2群體材料聚類分析

對群體材料的9個農藝性狀進行系統聚類分析。在歐式距離為30時將200份材料劃分為5類(圖2)。

第Ⅰ類包含單株13份，占BC2群體總數的6.5%。該類群二級側枝發達，莖葉比低，但未有多葉表達，株高性狀仍需改善，具有高產的潛力。

第Ⅱ類包含7份材料，占BC2群體總數的3.5%。該類群中包含兩株多葉單株，多葉表現在50%以下，株高、分枝數等性狀均低于其他4類

第Ⅲ類包含58份材料，占總數的29%。該類群包含多葉材料28份，且平均多葉率在5個類別中最高，綜合性狀偏向非輪回親本。

第Ⅳ類包含20份材料，占群體10%。該類別包含多葉單株3株，多葉率均在20%以下，平均株高74.95 cm，高于另外4個類別，平均分枝數13.3個，二級分枝發達，苜蓿生長過程中空間利用率高，綜合性狀偏向于非輪回親本，可用于選育高產苜蓿材料。

第Ⅴ類包含單株102株，占群體51%。該類別包含多葉單株21株，且具有多葉性狀表現良好的材料，平均株高72.23，分枝數14.45。該類別綜合性狀偏向于非輪回親本，但有部分單株很好地保留了非輪回親本的優良特性，綜合了雙親的優良性狀，是選育多葉改良的優秀苜蓿材料。

當歐式距離為40時，Ⅳ類和Ⅴ類合并，占群體的61%。表明通過回交，大部分的后代材料會逐步趨向于輪回親本，經過二次回交后，群體的性狀得到了一定程度的改良，但仍有必要進行更多次的回交以改良群體性狀。

圖2 苜蓿親本及回交二代群體9個農藝性狀聚類分析結果Fig.2 Cluster analysis of 9 agronomic traits of parents and population of the second backcrossing of alfalfa注：1～200：BC2材料；201：非輪回親本‘PL34HQ’；202：輪回親本‘淮陰苜蓿’。*標記單株為10株優良單株Note:1～200:materials of the second backcrossing generation;201:nonrecurrent parent ’PL34HQ’;202:recurrent parent ‘Huaiyin’. * marked individual plants is 10 excellent individual plants

2.4 BC2群體主要農藝性狀主成分分析

為揭示決定BC2農藝性狀表現型變異的主要農藝性狀，對9個農藝性狀進行了主成分分析。共有4個主成分因子入選，其累計貢獻率達到了86.21%，表明這4個主成分因子代表了9個農藝性狀在BC2代材料表現型變異的大部分信息。

主成分因子Y1反映了BC2后代材料性狀變異的30.83%，表達式為Y1=0.287X1+0.145X2+0.104X3+0.168X4+0.283X5—0.175X6—0.176X7+0.128X8+0.245X9。主成分因子Y1主要由X1(株高)、X5(莖粗)和X9(莖葉比)決定，因此可以認為第一主成分代表了苜蓿的莖生長能力。

主成分因子Y2反映了BC2后代材料性狀變異的22.37%，表達式為Y2=—0.070X1—0.087X2—0.386X3+0.401X4+0.039X5+0.146X6+0.169X7—0.184X8+0.299X9。主成分因子Y2主要由X3(節間數)、X4(節間長度)和X9(莖葉比)決定，第二主成分代表了苜蓿的節間性狀。

主成分因子Y3反映了BC2后代材料性狀變異的20.56%，表達式為Y3=0.247X1+0.233X2+0.247X3—0.053X4+0.100X5+0.422X6+0.409X7—0.073X8+0.021X9。主成分因子Y3主要由X6(主枝多葉率)、X7(單株多葉率)決定，第三主成分代表了苜蓿的多葉性狀。

主成分因子Y4反映了BC2后代材料性狀變異的12.46%，表達式為Y3=—0.142X1—0.407X2—0.092X3—0.022X4+0.420X5+0.188X6+0.195X7+0.662X8—0.092X9。主成分因子Y4主要由X8(側枝長度)決定，第四主成分代表了苜蓿的二級分枝性狀。

2.5 高多葉表達的單株與親本農藝性狀評價

通過公式Z=(0.30827×Y1+ 0.22366×Y2+0.20560×Y3+0.12456×Y4)/0.86212。計算BC2群體各單株材料的綜合得分評價指標,并對后代材料的得分進行排序(表3)。結果發現，所選10株優良單株均屬于第Ⅳ類和第Ⅴ類，且第Ⅴ類占比高，表明第5類類群中單株存在雜種優勢和超親優勢，能夠為高產、高質的苜蓿新品系提供種質資源，其中5號單株的Y3得分顯著高于其他單株，Y3代表苜蓿單株的多葉性狀，可作為多葉苜蓿回交的后續回交的親本。

表2 多葉苜蓿回交群體9個農藝性狀的主成分分析Table 2 Principal components analysis among 9 agronomic traits of population of the second backcrossing generation of alfalfa

表3 苜蓿BC2群體優良單株農藝性狀綜合得分Table 3 Comprehensive score of agronomic traits of excellent plants in population of the second backcrokssing generation of alfalfa

3 討論

本研究通過對苜蓿田間指標的相關性分析發現，株高與分枝數、莖粗、節間數、節間長度極顯著正相關、與側枝長度顯著正相關，這與前人結果一致[20-21]。苜蓿株高、分枝數、側枝長、節間數等性狀是影響產草量的重要性狀[22-23]，而隨著群體株高性狀的改善，分枝數、側枝長度、節間數、莖粗等產量相關性狀會隨之提高，群體中這些產量相關性狀間的正相關性能夠有效的改善苜蓿的產草量，而苜蓿的莖粗、節間長度會隨著苜蓿株高的增加而增加，這兩個要素的提高可能是群體中苜蓿株高提升后莖葉比提高的原因。相比于主莖，苜蓿的二級分枝的直徑小于主莖莖粗，或許是提高苜蓿產量、降低苜蓿莖葉比的另一個優良性狀。主枝多葉率與株高負相關但相關性不顯著，與楊艷婷[24]所得二者之間極顯著負相關有所不同，表明苜蓿多葉性狀受株高的影響經二次回交后降低，更多株高較高的苜蓿單株中也開始有多葉表現。主枝多葉率與單株多葉率極顯著正相關，這與楊艷婷的結果一致，表明苜蓿主枝多葉率高的同時苜蓿單株的單株多葉率也高，經二次回交后回交群體中苜蓿多葉性狀仍然能夠得到很好的表達。

結合苜蓿株高的頻數分布情況以及聚類分析分析結果，苜蓿BC2群體經過回交改良后，群體株高較多葉親本得到了明顯改良，苜蓿群體中大部分單株的各項農藝性狀趨向于輪回親本，占群體的61%。群體的主枝多葉率、單株多葉率、群體多葉率等與多葉性狀相關的性狀減幅較大，而株高、側枝長度、分枝數等與輪回親本有關的性狀得到了明顯的改良，這與滿強等人在小麥水旱地品種雜交獲得的結果相似[25]。于林清等[3]的研究結果表明多葉型苜蓿群體中后代多葉表達不穩定的主要因素是雜交了許多非多葉型的苜蓿花粉。而在本研究中，經回交后苜蓿群體中的群體多葉率較低僅有25.5%且群體中主枝多葉率呈現出下降趨勢，表明苜蓿的多葉性狀受基因的調控，隨著回交代數的增加，群體材料再次雜交了3葉輪回親本‘淮陰苜蓿’的花粉，群體中輪回親本的基因比例增加從而使群體中多葉表達下降。本研究認為苜蓿的多葉性狀由基因決定，柴小琴等[26]研究表明苜蓿的多葉性狀是由基因突變產生。但有多葉表達的苜蓿中多葉表現不盡相同，且有研究表明不同時期紫花苜蓿多葉表現具有較大差異[27]。苜蓿的多葉性狀由基因控制，其多葉表現的差異可能受其內源激素、養分等因素變化的影響，具體影響因素仍有待進一步研究。

通過計算主成分得分數值以及田間選育，群體中仍能選育出綜合得分高即綜合性狀優良且保留高多葉特性的后代材料，表明通過株高品系‘淮陰苜蓿’和多葉品系‘PL34HQ’的二代回交改良后，能夠獲得多葉率高且株高等性狀得到明顯改良的高產苜蓿材料。但隨著回交代數的增加，如果希望通過繼續回交獲得綜合性狀更優良的多葉苜蓿品系，擴大群體規模十分必要。本研究通過主成分得分的方式篩選回交群體中的優良單株，所得結果與實際測得結果一致，表明該方法在苜蓿回交后代的單株選育過程中具有應用價值。通過主成分值選種，在綜合得分最高的優良株系中選育目標性狀主成分值最高的株系，可使選育工作更具有目標性，提高選育效率和效果。

4 結論

BC2群體材料在綜合性狀上偏向于輪回親本‘淮陰苜蓿’，部分植株在保留非輪回親本高多葉特性的基礎上結合了‘淮陰苜蓿’的優良性狀，表現優于雙親。多葉性狀在回交群體中能很好的表達，株高、側枝長度、節間數等性狀中存在超親效應。BC2群體可分為5類，綜合了輪回親本‘淮陰苜蓿’和非輪回親本‘PL34HQ’優良性狀的第Ⅴ類占群體的51%。主成分分析所得4個主成分因子對各農藝性狀變異累計貢獻率為86.21%，其中主成分因子Y3代表苜蓿的多葉性狀，貢獻率為20.56%。通過綜合評價得分，篩選出了10個優良株系，且5號單株代表多葉性狀的第3主成分得分極高，可作為重點選育對象。