狼尾草屬象草PpPAPs基因的克隆及響應低磷脅迫的表達模式分析

黃 睿， 羅佳佳， 吳遠航， 劉攀道*， 劉國道*

(1.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，農業部華南作物基因資源與種質創制重點實驗室， 海南 海口 571101；2.海南大學熱帶作物學院， 海南 海口 570228)

磷(phosphorus，P)是植物生長發育所必需的大量營養元素，參與了植物細胞的膜與核苷酸合成、光合作用與能量轉換等各種新陳代謝過程[1]。無機磷酸鹽(inorganic phosphate，Pi)是能被植物根系直接吸收的主要磷形式，但其在土壤中易于被金屬離子與有機物固定，形成難于被植物直接吸收的難溶性磷和有機磷[2]。因此，在大多數耕作土壤，磷有效性低是限制作物增產的主要因素之一[3]。在傳統農業系統中，經常過量施用磷肥來維持作物生產，但這可能導致土壤加速退化和水體富營養化[4]。因此，選育磷高效作物品種并解析其適應低磷脅迫機理，對于減少磷肥施用量、發展生態農業具有重要意義。植物在長期進化過程中形成了一系列低磷脅迫適應機制，如根系形態構型的重塑、與叢枝菌根形成共生網絡、增強高親和力磷轉運子的表達及活性、分泌有機酸和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)到根際等[5-6]。值得注意的是，土壤中30%～65%的磷以有機磷的形式存在，如植酸磷、膜磷脂、核苷酸及其衍生物等[7]，但有機磷只有被ACP水解后釋放出Pi才能被植物利用[8]。從不同植物的根系中，已鑒定了眾多受低磷脅迫誘導增強表達的ACP，其中絕大多數由紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatase，PAP)家族基因編碼[9]。植物PAP屬于多基因家族(multigene family)，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和大豆(Glycinemax)的基因組中分別有29，26和38個PAP基因[10]。但是，已被證明在植物適應低磷脅迫過程中發揮生物學功能的PAP基因主要來源于雙子葉植物，如擬南芥、大豆、菜豆(Phaseolusvulgaris)和白羽扇豆(Lupinusalbus)等[9]，而單子葉植物中，僅水稻中的3個低磷響應PAP基因(OsPAP10a，OsPAP10c和OsPAP21b)被闡明了參與腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的利用[11]。對于其他單子葉植物，PAP基因對低磷脅迫的響應及其生物學功能仍有待深入研究。

象草(Pennisetumpurpureum)是禾本科狼尾草屬多年生大型草本植物[12]。象草具有生長快、產量高、分蘗多、再生性強、適口性好等特點，是一種適合在我國南方熱帶亞熱帶地區種植的優質飼草[13]。但在我國南方的酸性土壤中普遍存在磷有效性低的問題，象草對低磷脅迫的適應機理仍不清楚。本研究將分析象草對外源ATP的利用能力，隨后同源克隆了象草中可能參與ATP利用的3個PAP家族基因(PpPAPs)，并分析了PpPAPs響應低磷脅迫的表達模式，以期為解析象草適應低磷脅迫機理提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養條件

本研究所用象草材料由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所的“農業農村部儋州熱帶牧草種質資源圃”收集保存并提供。營養液配方如下：1 500 μmol·L-1KNO3，1 200 μmol·L-1Ca(NO3)2，400 μmol·L-1NH4NO3，25 μmol·L-1MgCl2，500 μmol·L-1MgSO4，300 μmol·L-1K2SO4，0.3 μmol·L-1(NH4)2SO4，1.5 μmol·L-1MnSO4，0.5 μmol·L-1CuSO4，1.5 μmol·L-1ZnSO4，0.16 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24，2.5 μmol·L-1NaB4O7，40 μmol·L-1Fe-Na-EDTA。象草的營養液水培試驗方法如下：選取長度為10 cm左右的象草種芽，在含600 μmol·L-1KH2PO4的營養液中預培養使其生根。預培養10 d后，選擇長勢均一的幼苗，分別移至添加不同磷源的營養液中進行處理，即：添加600 μmol·L-1KH2PO4(+P處理)、添加200 μmol·L-1ATP(+ATP處理)和不添加KH2PO4(-P處理)。每隔5 d更換一次營養液，每個處理設4個生物學重復。分別在處理5 d，10 d和15 d后分地上部和根部收取樣品。

1.2 方法

1.2.1干重與全磷含測定 將所收樣品放入烘箱于70℃烘干至恒重后稱干重。象草干樣品粉碎后稱取50 mg于消煮管中，先用雙蒸水濕潤后，再加濃硫酸2 mL，搖勻，在消煮爐中消解，期間加2～3次過氧化氫，每次加5～10滴，消解至無色后再消解1 h。消解完成后冷卻，用雙蒸水定容至100 mL，澄清后溶液待測。參照Murphy和Riley[14]的方法測定全磷含量，取適量體積的樣品磷待測液，用雙蒸水定容至1.8 mL后加入0.2 mL鉬銻抗顯色液，混勻并靜置30 min后測定OD700的吸光度值。

1.2.2ACP活性測定 根系胞內ACP活性測定：稱取根系鮮樣品100 mg，加入2 mLTris-HCl緩沖液(0.1 M，pH 8.0)，冰浴研磨成勻漿，12 000 rpm離心15 min，收集上清液即為胞內蛋白提取液。參照Bradford[15]的方法測定蛋白濃度。酶活性的測定參照Liang等[16]的方法，取一定體積蛋白提取液于2 mL離心管中，用雙蒸水定容至0.2 mL，加入0.8 mL含2 mM ATP底物溶液(用pH 5.5的20 mM Tris-HCl緩沖液配制)，搖勻，于35℃反應15 min后加入0.5 mL三氯乙酸溶液(10%)終止反應。空白對照以20 mM Tris-HCl緩沖液(pH 5.5)替代底物溶液，用于評估王草根系樣品中的含磷量。ACP催化底物水解后釋放出的磷，參照Irving和McLaughlin[17]的孔雀石綠定磷法測定。酶活性用單位蛋白(mg)的酶活力單位(U)表示。根系分泌ACP活性測定以ATP為底物，參照黃睿等[18]的方法進行。

1.2.3象草PpPAPs的同源克隆與進化樹分析 為克隆象草中分別與OsPAP10a(Gene loci:Os01 g56880)、OsPAP10c(Gene loci:Os12 g44020)和PvPAP3(Gene loci:Phvul.002G181500)同源的基因序列，分別根據這3個PAPs的保守結構域序列設計EST擴增引物PpPAP3/10a/10c-EST-F/R，通過PCR擴增出它們的EST片段并測序。隨后，根據這3個PpPAPs的EST序列設計5′末端特異擴增引物PpPAP3/10a/10c-5′RACE-R和3′末端特異擴增引物PpPAP3/10a/10c-3′RACE-F，并分別與通用引物RACE-UPM和RACE-NUP配對，采用cDNA末端快速擴增試劑盒SMARTer RACE 5′/3′Kit(Clontech，美國)，分別擴增出它們的5′和3′末端序列并測序。每個PpPAP的EST，5′和3′端序列，通過MEGA 5軟件拼接后獲cDNA全長序列。設計引物PpPAP3/10a/10c-ORF-F/R進行PCR擴增全長序列并測序驗證。本研究所用引物見表1。多序列比對與蛋白進化樹構建分別采用Cluster X和MEGA 5軟件。蛋白分子量與等電點預測采用Editseq軟件。

表1 本研究所用引物列表Table 1 A list of primers used in the study

1.2.4熒光定量PCR(qRT-PCR) 象草鮮樣使用RNA-solve試劑盒(Omega Biotech，美國)提取總RNA。經DNase I處理后的RNA通過M-MLV逆轉錄酶(Promega，美國)合成cDNA第一鏈。qRT-PCR用SYBR Premix ExTaq II(Takara，日本)試劑盒在Rotor-Gene RG-3000實時熒光定量PCR儀(Corbett Research，澳大利亞)上進行。3個PpPAPs基因的qRT-PCR引物PpPAP3/10a/10c-RT-F/R見表1。以象草的肌動蛋白actin 1編碼基因(PpACT1，NCBI accession number：MT784734)為內參看家基因。基因相對表達量參照Larionov等[19]的方法計算，即：基因相對表達量=目的基因表達量/內參看家基因表達量。

1.3 數據統計分析

本研究相關數據結果以平均值和標準誤(SE)表示，數據單因素方差分析和相關性分析均通過SPSS 18.0軟件(IBM-SPSS，美國)進行，分別采用多重比較LSD法和Pearson法。數據可視化作圖采用Microsoft Excel 2013軟件(Microsoft，美國)。

2 結果與分析

2.1 象草對有機磷的利用能力評價

水培條件下對象草進行-P,+ATP和+P處理，分別在5 d,10 d和15 d后收取樣品測定植株干重和全磷含量。如圖1A所示，不同磷源處理5 d 的植株干重無顯著差異，但10 d和15 d后，+ATP處理下的植株干重比-P處理增加38.7%～73.4%，差異顯著(P<0.05)。對于全磷含量，從5～15 d，+ATP處理與-P處理相比增加1.6～2.6倍，差異顯著(P<0.05)(圖1B)。但是，處理10 d和15 d后，+ATP處理下的植株干重與全磷含量均低于+P處理，差異顯著(P<0.05)(圖1)。以上結果表明，象草對外源有機磷源(+ATP)具有利用能力，但低于對無機可溶性磷源(+P)的利用能力。

圖1 不同磷源對象草植株干重(A)與全磷含量(B)的影響Fig.1 Effects of different P sources on plant dry weight (A) and total P content (B) in elephant grass注：-P為不添加KH2PO4處理，+ATP為添加200 μmol·L-1 ATP處理，+P為添加600 μmol·L-1 KH2PO4處理。不同的小寫字母表示在同一處理時間下，不同磷源處理之間差異顯著(P<0.05)，下同Note:-P indicated no KH2PO4added treatment,+ATP indicated 200 μmol·L-1 ATP added treatment,+P indicated 600 μmol·L-1 KH2PO4 added treatment. Different lowercase letters indicate significant differences among different P sources at the 0.05 level at the same treatment time,the same as below

2.2 不同磷源處理對象草根系ACP活性的影響

如圖2A所示，處理5～15 d之后，與+P處理相比，-P和+ATP處理分別使根系胞內ACP活性分別提高1.1～2.7倍和0.9～2.0倍，差異顯著(P<0.05)。而對于根系分泌ACP活性，不同磷源處理5 d時無顯著差異(圖2B)；但處理10～15 d后，-P和+ATP處理的根系分泌ACP活性分別比+P處理分別提高2.2～5.1倍和1.9～2.7倍，差異顯著(P<0.05)(圖2B)。以上結果說明，象草在有效磷缺乏條件下(-P和+ATP處理)，會增加根系ACP的合成與分泌。

2.3 象草PpPAPs基因的克隆及蛋白進化樹分析

為克隆象草中與水稻OsPAP10a，OsPAP10c及菜豆PvPAP3的同源基因，分別根據這3個基因的保守結構域序列設計引物，通過PCR擴增獲得了象草中3個同源基因的EST序列。隨后通過RACE技術，獲得了象草的這3個PpPAPs基因cDNA全長序列，開放閱讀框(ORF)分別為1 083 bp，1 422 bp和1 389 bp(圖3)，并將它們分別命名為PpPAP3，PpPAP10a及PpPAP10c(NCBI accession number：MT784735,MT784736,MT784737)。PpPAP3，PpPAP10a和PpPAP10c預測的蛋白分子量分別為40.6 kDa，53.7 kDa和52.1 kDa；蛋白等電點分別為5.9，6.7和6.8。隨后的蛋白進化樹分析表明，植物的PAPs可被分為Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ共3個亞家族，其中Ⅰ亞家族可進一步被分為Ⅰa-1，Ⅰa-2，Ⅰb-1和Ⅰb-2共4個子族；Ⅱ亞家族包含Ⅱa和Ⅱb兩個子族；Ⅲ亞家族包含Ⅲa和Ⅲb兩個子族(圖4)。Ⅰ和Ⅱ亞家族為大分子量PAPs，而Ⅲ亞家族為小分子量PAPs。象草的PpPAP10a及PpPAP10c屬于Ⅰa-2子族，分別與水稻的OsPAP10a和OsPAP10c同源；而PpPAP3屬于Ⅲb子族，與擬南芥的AtPAP3同源(圖4)。

圖2 象草在不同磷源處理下的根系胞內酸性磷酸酶(A)和根系分泌酸性磷酸酶(B)活性Fig.2 Root intracellular ACP activity (A) and root secreted ACP activity (B) of elephant grass at different P sources

圖3 象草PpPAPs全長cDNA的克隆Fig.3 Full length cloning of PpPAPs in elephant grass注：泳道1，PpPAP3的ORF擴增片段；泳道2，PpPAP10a的ORF擴增片段；泳道3，PpPAP10c的ORF擴增片段Note:lane 1,ORF amplified fragment of PpPAP3;lane 2,ORF amplified fragment of PpPAP10a;lane 3,ORF amplified fragment of PpPAP10c

2.4 象草PpPAPs基因在根系中的表達模式分析

利用qRT-PCR技術，分析不同磷源處理下象草根系中3個PpPAPs基因的表達模式。如圖5A所示，與+P處理相比，-P和+ATP處理5～15 d，分別使PpPAP3在根系的相對表達量增加2.1～7.2倍和1.5～2.9倍，差異顯著(P<0.05)。對于PpPAP10a，在-P和+ATP處理5～10 d的根系中，相對表達量比+P處理分別增加1.4～5.2倍和1.0～4.0倍，差異顯著(P<0.05)；但處理15 d時，PpPAP10a在不同磷源處理根系中的相對表達量無顯著差異(圖5B)。與PpPAP3和PpPAP10a不同，-P和+ATP處理5 d對PpPAP10c在根系中的相對表達量無影響；但處理10～15 d后，-P和+ATP處理分別使PpPAP10c在根系的相對表達量比+P處理提高1.9～9.0倍和1.7～21.3倍，差異顯著(P<0.05)(圖5C)。隨后，對不同磷源處理下3個PpPAPs基因在象草根系中的表達量水平與根系ACP活性進行Pearson相關性分析，結果如圖6所示，PpPAP3和PpPAP10a的相對表達量與根系胞內ACP和分泌ACP活性均顯著正相關，但PpPAP10c的相對表達量與根系胞內ACP和分泌ACP活性均無顯著相關性。以上結果表明，在有效磷缺乏條件下(-P或+ATP處理)，象草根系會誘導PpPAPs基因增加表達，且PpPAP3和PpPAP10a基因的表達水平與根系ACP活性密切相關。

圖4 象草紫色酸性磷酸酶的系統進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of purple acid phosphatase in elephant grass注：PAP蛋白的前兩個字母表示物種拉丁名簡寫Note:The first two letters of each PAP protein label represent the abbreviated species name

圖5 不同磷源處理下象草根系PpPAP3(A)，PpPAP10a(B)和PpPAP10c(C)的相對表達量Fig.5 Relative expression levels of PpPAP3 (A),PpPAP10a (B) and PpPAP10c (C) in roots of elephant grass under different P treatment

圖6 象草根系PpPAPs相對表達量與胞內ACP(A)或分泌ACP(B)活性的相關性分析Fig.6 Correlation analysis between relative expressions of PpPAPs and intracellular ACP activity (A) or secreted ACP activity (B) in roots of elephant grass注：R表示相關系數。R2表示相關系數的平方值(決定系數)。*表示在P<0.05水平顯著正相關，**表示在P < 0.01水平顯著正相關，N.S.表示無顯著相關性Note:R represents correlation coefficient. R2 is the square of the correlation coefficient (coefficient of determination). A single asterisk indicates significant positive correlation at the 0.05 level,two asterisks indicates significant positive correlation at the 0.01 level. N.S. indicates no significant correlation

3 討論

有機磷是土壤磷庫的重要組分，但其不能被根系直接吸收[20]。通過根系的ACP水解外源有機磷釋放出Pi，是植物適應低磷脅迫的機制之一[21]。為評估象草對外源有機磷(ATP)是否具有利用能力，本研究首先通過水培試驗分析不同磷源對象草生長的影響，結果發現，+ATP處理處理15 d后的象草生物量比-P處理高出70%以上(圖1)，說明象草能夠活化利用外源ATP。

植物ACP可被分為胞內ACP和分泌型ACP兩類[22]。胞內ACP指定位于細胞質及胞內細胞器中的ACP，主要參與植物細胞內貯存有機磷庫的再活化利用。分泌型ACP主要是從植物根系分泌到根際或質外體的這類ACP，主要功能是參與植物對土壤有機磷的活化利用[23]。在單子葉作物(如水稻、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)等)和雙子葉作物(如菜豆、大豆、白羽扇豆等)中均發現，低磷脅迫會誘導胞內ACP活性增加，并伴隨著大量ACP從根系分泌到根際[24-25]。本研究中，ACP活性的定量測定發現，象草根系胞內和分泌的ACP活性在有效磷缺乏條件下(-P和+ATP處理)均顯著提高(圖2)。以上結果表明，增加ACP的合成與分泌是植物中普遍存在的適應低磷脅迫機制。

由于根系分泌ACP在土壤有機磷利用中的重要作用，在不同植物中，已有眾多低磷脅迫誘導ACP被鑒定，其中絕大多數屬于紫色酸性磷酸酶(PAP)家族[26]。但是，這些被證明參與植物適應低磷脅迫的PAP成員，主要來源于雙子葉植物，如擬南芥AtPAP10,AtPAP12和AtPAP26參與對腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)的活化利用[27]；大豆GmPAP4和GmPAP14參與植酸磷的活化利用[28]；菜豆PvPAP3參與ATP的活化利用[16]；柱花草SgPAP7,SgPAP10和SgPAP26參與脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的活化利用[29]。而對于單子葉植PAP基因在低磷脅迫適應中的功能研究，僅水稻3個OsPAPs(OsPAP10a/10c/21b)被證明參與ATP的活化利用[30]。為挖掘象草中潛在參與ATP利用的PAP成員，本研究從象草中分別克隆了與OsPAP10a,OsPAP10c和PvPAP3同源的3個PpPAPs基因(圖3)。隨后的表達模式分析表明，在有效磷缺乏條件下(-P或+ATP處理)，這3個PpPAPs基因在象草根系不同程度的增強表達(圖5)。其中，PpPAP3和PpPAP10a的相對表達量與根系ACP活性顯著正相關關系(圖6)。這些結果表明，PpPAPs可能參與了象草對ATP的利用，但有待進一步的基因功能分析試驗來驗證。

4 結論

本研究證明了象草對外源ATP具有利用能力，并從象草中首次克隆了3個受低磷脅迫上調表達的PpPAPs基因。研究結果將為解析象草磷素高效利用機理提供一定基礎。