HPLC-DAD同時測定風熱感冒顆粒中6種活性成分的含量△

劉斌

泰安市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 泰安 271000

風熱感冒顆粒是由苦杏仁、板藍根、桑葉、連翹、菊花、牛蒡子等11味中藥提取制成的顆粒劑，具有清瘟解毒、宣肺利咽之功效，主要用于感冒身熱、鼻塞、頭痛、咳嗽、多痰等癥[1]。目前執(zhí)行的質(zhì)量標準中只有顆粒劑的通則檢驗，無含量測定項目[1]，相關研究中也只有連翹苷和牛蒡苷的含量測定[2-4]。風熱感冒顆粒中，苦杏仁中的苦杏仁苷具有止咳平喘的作用[5-6]；板藍根中的(R，S)-告依春具有抗病毒的作用[7-8]；桑葉中的蘆丁具有抗病毒、抑菌的作用[9-10]；連翹中的連翹酯苷A具有抗菌、抗炎的作用[11-12]；菊花中的3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸具有抑菌、抗病毒的作用[13-14]；牛蒡子中的牛蒡苷具有抗炎、解熱的作用[15-16]。經(jīng)查閱文獻資料，針對上述6種成分在不同中成藥中的含量測定研究的報道較多[17-30]，但未見關于風熱感冒顆粒中多種成分含量同時測定的方法研究。本研究首次以苦杏仁中的苦杏仁苷，板藍根中的(R，S)-告依春，桑葉中的蘆丁，連翹中的連翹酯苷A，菊花中的3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸，牛蒡子中的牛蒡苷為定量指標，同時對風熱感冒顆粒中的6種成分進行含量測定。本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法(HPLC-DAD)，分別在207、245、330 nm波長下，同時測定風熱感冒顆粒中6種活性成分的含量，有利于快速、全面地評價其質(zhì)量，為風熱感冒顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀、SPD-M20A型二極管陣列檢測器(日本島津公司)；LC solution色譜工作站；XS205DU型十萬分之一電子天平(Mettler-Toledo公司)。

1.2 試藥

對照品苦杏仁苷(批號：110820-201607，純度：90.7%)、(R，S)-告依春(批號：111753-201706，純度：100%)、蘆丁(批號：100080-200707，純度：90.5%)、連翹酯苷A(批號：111810-201707，純度：97.2%)、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸(批號：111782-201706，純度：97.3%)、牛蒡苷(批號：110819-201309)均由中國食品藥品檢定研究院提供。

風熱感冒顆粒(山東孔府制藥有限公司，批號分別為20170404、20171002、20180414、180402；云南白藥集團股份有限公司，批號分別為ZAA1735、ZAA1736；吉林龍?zhí)┲扑幑煞萦邢薰荆柗謩e為170606、180309；貴州百靈企業(yè)集團制藥有限公司，批號分別為20170613、20170810；吉林長白山藥業(yè)集團股份有限公司，批號分別為170606、180301；山西天成制藥有限責任公司，批號：318005；懷化正好制藥有限公司，批號分別為180412、180403；廣東恒誠制藥有限公司，批號：1806201；規(guī)格均為10 g/袋)；乙腈為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SymmetryShieldTMRP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～12 min，15%A；12～13 min，15%～10%A；13～26 min，10%～25%A；26～30 min，25%～35%A；30～40 min，35%A)；檢測波長：苦杏仁苷、牛蒡苷為207 nm，(R，S)-告依春為245 nm，蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸為330 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷6種成分的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于6000。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品儲備液和混合對照品溶液 稱取苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為9.20、0.16、1.76、1.10、2.16、15.20 mg·mL-1的對照品儲備液。再分別精密量取對照品儲備液1 mL，置于同一20 mL量瓶中，加甲醇制成含苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷分別為460、8、88、55、108、760 μg·mL-1的混合對照品溶液，備用。

2.2.2供試品溶液 取本品研細，精密稱取10 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率：300 W，頻率：50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，6000 r·min-1離心(離心半徑3.5 cm)10 min，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3陰性供試品溶液 按《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第一冊中風熱感冒顆粒的處方，分別制備缺少苦杏仁、板藍根、桑葉、連翹、菊花和牛蒡子藥味的陰性樣品，并按2.2.2項下的制備方法制備陰性供試品溶液。

2.3 專屬性試驗

按2.1色譜條件，分別取對照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液依法測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，不同的陰性供試品溶液中分別在與苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷對照品溶液的色譜圖中相同保留時間處無色譜峰，表明處方中其他藥味對待測成分無干擾，方法的專屬性良好。見圖1。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取2.2.1項下6種對照品儲備液各0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mL，分別置20 mL量瓶中，并加甲醇定容，制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按2.1色譜條件依法測定。以質(zhì)量濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸，結(jié)果見表1，表明各成分的線性關系良好。

注：A1～A3.混合對照品；B1～B3.風熱感冒顆粒；C.缺苦杏仁陰性樣品；D.缺板藍根陰性樣品；E.缺桑葉陰性樣品；F.缺連翹陰性樣品；G.缺菊花陰性樣品；H.缺牛蒡子陰性樣品；1.苦杏仁苷；2.(R，S)-告依春；3.蘆丁；4.連翹酯苷A；5.3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸；6.牛蒡苷。圖1 風熱感冒顆粒HPLC圖

表1 風熱感冒顆粒中6種成分線性關系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗

取2.2.1項下混合對照品溶液，按2.1色譜條件依法測定，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，并以不同成分的峰面積計算精密度，苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷峰面積的RSD分別為0.2%、0.3%、0.2%、0.1%、0.1%和0.2%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批樣品(批號：20180414)，按2.2.2項下方法，制備平行樣品溶液6份，按2.1色譜條件依法測定，并分別計算不同成分的含量，以平均含量(n=6)考察重復性，苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷含量的RSD分別為0.7%、0.8%、0.6%、0.5%、0.4%和0.5%，表明該方法的重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批樣品(批號：20180414)，按照2.2.2項下方法制備樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h按2.1色譜條件依次進行測定，記錄峰面積，以峰面積考察精密度，苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷峰面積的RSD分別為0.4%、0.5%、0.5%、0.3%、0.4%和0.5%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取一批已知指標成分含量的樣品(批號：20180414)，每份稱取5 g，精密稱定，共稱取9份，每3份為一組，分別精密加入0.5、1.0、1.5 μL苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷峰的對照品儲備液，照2.2.2項下方法制備加樣回收供試品溶液，按2.1項下色譜條件依法測定，分別計算6種成分的加樣回收率。結(jié)果見表2，表明該方法的準確度良好。

表2 風熱感冒顆粒中6種成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

2.9 樣品測定

分別取16批樣品，均按2.2.2項下方法各制備供試品溶液2份，按2.1項下色譜條件依法測定，用外標法分別計算樣品中苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷峰的含量，結(jié)果見表3。

表3 風熱感冒顆粒中6種成分的含量 μg·g-1

3 討論

3.1 波長的選擇

風熱感冒顆粒由11味中藥成分組成，由于待測的6種成分紫外光譜差異較大，為了用1種方法能同時檢測6種活性成分，故采用HPLC-DAD，不同波長同時檢測各成分的含量。分析各成分的紫外全波長掃描結(jié)果，并分別參照《中華人民共和國藥典》2015年版一部苦杏仁、板藍根、桑葉、連翹、菊花和牛蒡子項下含量測定方法，苦杏仁苷和牛蒡苷均在207 nm波長處有較大吸收，且分離度較好，無干擾峰出現(xiàn)，所以選擇207 nm作為其共同的測定波長；(R，S)-告依春在245 nm波長處有最大吸收，并且無雜峰干擾，故選擇此波長檢測；蘆丁、連翹酯苷A和3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸雖在207 nm處有較大吸收，但樣品中干擾較多，分離效果不好，在330 nm波長處有較大吸收，且無干擾，因此選擇330 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

參照相關文獻[17-31]，比較了乙腈-水、乙腈-0.1%的磷酸溶液、甲醇-水和甲醇-0.1%磷酸溶液4種不同的流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，峰形較好，且分離效果好。試驗采用梯度洗脫，通過對乙腈和0.1%的磷酸溶液的比例進行優(yōu)化，使得待測的6種成分保留時間適宜，分離效果較好，見圖1。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇

分別以甲醇、50%甲醇和水為溶劑，并且分別采取超聲15、30、45 min提取，通過對比提取效果，顆粒在甲醇中溶解性差，部分待測成分在水中的溶解度較低，6種待測成分在50%甲醇中提取效果均較好，雜峰的干擾較少，實驗結(jié)果表明，超聲30 min已提取完全。

3.4 樣品結(jié)果分析

經(jīng)方法學驗證，本方法測定結(jié)果專屬性強、準確度高、重復性好，可用于風熱感冒顆粒的質(zhì)量控制。本研究檢測了8個不同廠家共16批樣品，發(fā)現(xiàn)同廠家的樣品差別較小，但不同廠家之間的樣品差別較大，且部分廠家的待測成分含量遠遠小于理論值，甚至有的成分未檢出。分析原因認為，主要為原料差異和工藝差別，也可能存在部分廠家未能按處方量投料的情況。風熱感冒顆粒現(xiàn)行標準未設含量測定項目，通過本研究建立的同時檢測風熱感冒顆粒中6種活性成分的含量的方法，有助于提升對該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。