不同規格青皮飲片指紋圖譜△

陳芳，梁月儀，童培珍，王利偉，劉曉霞，孫冬梅，李國衛

廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244

青皮始載于《珍珠囊》，其味苦、辛，性溫，具有疏肝破氣、消積化滯的功效，用于治療胸脅脹痛、疝氣疼痛、乳癖、乳癰、食積氣滯、脘腹脹痛等病癥[1]?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版規定，青皮為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco 及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮。其中收載了“個青皮”與“四花青皮”2種規格，5—6月收集自落的幼果，曬干，習稱“個青皮”；7—8月采收未成熟的果實，在果皮上縱剖成4瓣至基部，除盡瓤瓣，曬干，習稱“四花青皮”[2]。青皮的主要成分有揮發油類、黃酮類、生物堿類，其中黃酮類成分包括橙皮苷、橘皮素、川陳皮素等，是青皮的主要藥效物質基礎[3-7]。現代藥理研究表明，青皮具有調節腸胃功能、去痰平喘、利膽、治療乳腺增生等作用[8-11]。

2種規格的青皮在功能主治和成分組成上略有不同。個青皮以破氣化滯為主，四花青皮以調肝理氣為主。根據現有文獻報道[12]，個青皮與四花青皮在橙皮苷、辛弗林、N-甲基酪胺、揮發油的含量上均有差異，多種因素對不同生長發育階段活性成分的積累具有一定影響。本研究對比分析了2種規格青皮的指紋圖譜，為不同規格青皮的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Vanquish型超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；ME204E型萬分之一分析天平、XP26型百萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；HWS28型恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(默克股份有限公司)。

1.2 試藥

對照品辛弗林(批號：110727-201608，純度：99.9%)、橙皮苷(批號：116721-201617，純度：96.1%)為中國食品藥品檢定研究院提供；對照品蕓香柚皮苷(批號：14259-46-2，純度≥98%)、川陳皮素(批號：150921，純度≥98%)、橘皮素(批號：151021，純度≥98%)為成都普菲德生物技術有限公司提供；甲醇為分析純；乙腈、甲酸為色譜純；水為超純水。

11批四花青皮飲片和11批個青皮飲片經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco 及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮，存放于廣東一方制藥有限公司，見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈為流動相A，以0.1%甲酸水為流動相B，梯度洗脫(0～2 min，1%～8%A；2～5 min，8%～13%A；5～12 min，13%～19%A；12～13 min，19%～22%A；13～20 min，22%～35%A；20～21 min，35%～51%A；21～30 min，51%～54%A)；檢測波長：275 nm；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取蕓香柚皮苷、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素、辛弗林對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇制成各含蕓香柚皮苷84.7 μg·mL-1、橙皮苷78.5 μg·mL-1、橘皮素88.85 μg·mL-1、川陳皮素85.7 μg·mL-1、辛弗林85.3 μg·mL-1的混合對照品溶液。

表1 青皮飲片樣品信息

2.3 供試品溶液的制備

取本品細粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流30 min，取出，放冷，再稱定質量，用10%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1專屬性試驗 取青皮飲片(S01)供試品溶液、對照品溶液、空白溶劑(10%甲醇)依次進樣檢測，考察實驗方法的專屬性。結果表明，樣品中各個色譜峰不受空白溶劑的干擾，其中辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的保留時間與對照品色譜峰的保留時間一致，表明該方法具有良好的專屬性。見圖1。

注：A.混合對照品溶液；B.空白試劑；C.供試品溶液；1.辛弗林；3.蕓香柚皮苷；4.橙皮苷；6.川陳皮素；7.橘皮素；圖2～3同。圖1 個青皮飲片指紋圖譜專屬性考察UPLC圖

2.4.2精密度試驗 取同一青皮飲片供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，以橙皮苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.04%～3.25%、0.48%～2.48%，表明分析方法精密度良好。

2.4.3重復性試驗 平行制備6份青皮飲片(S01)供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，以橙皮苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.02%～1.36%、0.53%～1.79%，表明該方法的重復性良好。

2.4.4穩定性試驗 取青皮飲片(S01)供試品溶液，分別于制備后0、2、6、11、15、18 h，按2.1項下色譜條件測定，以橙皮苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.04%～2.75%、0.42%～2.95%，表明供試品溶液在18 h內穩定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及分析

2.5.1共有模式及共有峰的確定 按2.3項下方法制備供試品溶液，根據已建立的特征圖譜方法對各批次供試品溶液進行測定，通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012 版)，以平均數法得到青皮飲片指紋圖譜共有模式，匹配到7個穩定的共有峰，且分離度較好，具有指紋圖譜特征性，可初步擬定為青皮飲片的指標成分群。因此，確定這7個峰為青皮飲片的共有峰。在15.73 min處的為橙皮苷色譜峰，橙皮苷峰分布正態，達到基線分離，且峰面積較大，所以確定為參照峰。以4號峰橙皮苷峰為參照峰，不同規格青皮飲片各批的共有峰的相對保留時間、相對峰面積見表2～3，指紋圖譜的疊加圖見圖2～3。

2.5.2不同規格的青皮指紋圖譜相似度評價 采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)，以青皮飲片生成的共有模式作為參照圖譜，分別計算個青皮、四花青皮相似度，結果見表4。各批次個青皮的相似度為0.927～1.000、四花青皮的相似度為0.953～1.000，表明個青皮、四花青皮質量穩定，成分組成差異小。

表2 青皮飲片樣品 UPLC 指紋圖譜分析結果(相對保留時間)

表3 青皮飲片樣品 UPLC 指紋圖譜分析結果(相對峰面積)

圖2 個青皮飲片樣品UPLC指紋圖譜疊加

圖3 四花青皮飲片樣品UPLC指紋圖譜疊加

2.5.3不同規格青皮飲片各特征峰峰面積差異分析 運用SPSS 20.0軟件對不同規格青皮飲片各特征峰峰面積進行獨立樣本檢驗，各特征峰峰面積見表5，檢驗結果見表6，顯示峰1、峰5、峰6、峰7峰面積差異具有統計學意義(P<0.05)，說明不同規格青皮飲片其成分的組成基本上是一致的，但是成分含量比例存在差異。

3 討論

本實驗的樣品分別采自浙江、湖南、湖北、江西4個產地，個青皮與四花青皮都具有7個特征峰，相似度均大于0.85，說明不同規格青皮飲片其成分的組成基本上是一致的。說明不同生長期的青皮，遺傳因子相同，生長期不同即環境因子、氣候因子、光照不同，其所含主要化學成分種類相近。藥用植物是中藥資源的主體，次生代謝產物為其主要活性成分，不同生長時期，其代謝主要活性成分含量比例不同。個青皮與四花青皮成分含量存在差異，與產地、生長時期、采收期、加工方法等因素有關，有待深入研究。

在有關文獻的基礎上，采用二極管陣列檢測器(DAD)對青皮供試品溶液進行紫外掃描(190～400 nm)，分別比較230、284、275、320 nm波長下的色譜圖，發現275 nm波長下整體性峰形較好、吸收強、色譜峰數較多且各峰之間的分離度較好，能夠全面反映青皮的物質基礎。故選者275 nm作為指紋圖譜最佳波長[13]。同時考察了不同流動相(乙腈-0.5%冰乙酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液、0.1%甲酸溶液)，選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相并對洗脫梯度進行優化，以達到較好的峰形及分離效果。同時對不同柱溫、不同色譜柱等色譜條件進行篩選優化，最終確定2.1項下色譜條件。此外，對樣品的提取溶媒、提取方式、提取時間和溶媒用量進行考察，確定供試品溶液的制備方法。建立的方法簡單、高效，可用于青皮飲片的質量評價。

表5 青皮飲片各特征峰峰面積

表6 不同規格青皮飲片各特征峰峰面積獨立樣本檢驗

本實驗采用UPLC建立青皮指紋圖譜，對共有峰進行指認，對不同規格青皮指紋圖譜特征峰進行差異分析。采用對照品指認了峰1為辛弗林，峰3為蕓香柚皮苷、峰4為橙皮苷、峰6為川陳皮素、峰7為橘皮素，峰3、4、6、7為黃酮類成分；采用獨立樣本檢驗，結果顯示，不同規格青皮飲片其峰1、5、7峰面積差異具有統計學意義(P<0.05)，個青皮中辛弗林、川陳皮素、橘皮素峰面積均高于四花青皮，表明不同規格的青皮在辛弗林、川陳皮素、橘皮素等成分的含量存在差異。文獻研究報道，從幼果期到成熟期，青皮中辛弗林的含量均呈現遞減的變化趨勢，總黃酮的含量隨果實成熟度的增加呈現降低的趨勢[12，14-15]。本研究結果顯示，個青皮中辛弗林高于四花青皮，與文獻報道一致。這些說明青皮的生長發育時期，物質形成不是簡單的從少到多，而是隨著生長發育，有些成分減少，有些成分增加。這與其在植物體內的代謝轉化過程相關，多種因素對不同生長發育階段物質成分的積累具有一定影響。個青皮、四花青皮有效物質含量存在差異，與其臨床應用有所側重相一致。因此，建議在質量標準中個青皮、四花青皮可建立相同的含量測定指標，但標準范圍應當不同，以期有針對性地控制不同規格青皮質量。