淡竹葉浸出物提取方法的建立及其質量標準研究△

魯云，李燕珍，林碧珊，王壽富，魏梅，孫冬梅，梁志毅

廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244

淡竹葉始載于《滇南本草》[1]，《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版記載淡竹葉為禾本科植物淡竹葉LophatherumgracileBrongn.的干燥莖葉，其性寒，味苦，具有清熱瀉火、除煩止渴、利尿通淋等功效[2]，主要分布于我國廣東、湖南、廣西、福建、浙江、安徽等地[3]。有相關文獻記載，淡竹葉的化學成分主要以黃酮類為主，此外，還有揮發油類、三萜類、酚酸、多糖、氨基酸等[4-6]。現代藥理研究表明，淡竹葉有解熱、利尿、鎮痛、抗菌等作用[7]，除作藥用外，淡竹葉還可應用于食品、保健品等領域[8]。隨著淡竹葉的廣泛應用，如何控制淡竹葉浸出物的質量標準成為亟待解決的問題。目前，除2010年版《湖南省中藥飲片炮制規范》有收載“淡竹葉的浸出物檢查”外(其采用熱浸法70%乙醇作溶劑提取，并要求浸出物得率不得少于9.0%)，歷版《中國藥典》與其他各地中藥飲片炮制規范對淡竹葉藥材的質量控制指標均未有浸出物的相關記載[9]。因此，淡竹葉浸出物的最佳提取方法以及質量標準尚無明確參考依據。

本研究對淡竹葉浸出物得率、異葒草苷含量、日當藥黃素含量、特征圖譜總峰面積及過濾速度進行綜合評價，優選淡竹葉的浸出物提取方法，建立淡竹葉浸出物質量控制指標，為其他藥材浸出物的提取及其浸出物質量控制指標的建立提供實驗參考。

1 材料

1.1 儀器

H-class型超高效液相色譜儀、光電二極管陣列檢測器(PDA)、Empower工作站(沃特世公司)；KQ-700DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(默克股份有限公司)；ME204E型萬分之一天平(Mettler Toledo公司)；DHG-9147A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 試藥

異葒草苷對照品(批號：111974-201401，純度：94.0%，中國食品藥品檢定研究院)；日當藥黃素對照品(批號：18082822，純度：99.7%，上海同田生物技術股份有限公司)；乙醇(分析純，天津市永大化學試劑有限公司)；磷酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，默克股份有限公司)；水(Milli-Q Direct超純水)。

12批淡竹葉藥材來源信息見表1，經過廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為禾本科植物淡竹葉LophatherumgracileBrongn.的干燥莖葉，且符合《中國藥典》2015年版要求。

表1 淡竹葉樣品信息

2 方法

2.1 浸出物提取方法

2.1.1冷浸法 取淡竹葉藥材供試品約4 g，精密稱定，共12份，分別以水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇為溶劑(每種溶劑平行測定3份)，按照《中國藥典》2015年版通則2201項下冷浸法測定，依次計算浸出物得率，并記錄過濾速度快慢。

2.1.2熱浸法 取淡竹葉藥材供試品約4 g，精密稱定，共12份，分別以水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇為溶劑(每種溶劑平行測定3份)，按照《中國藥典》2015年版通則2201項下熱浸法測定，依次計算浸出物得率，并記錄過濾速度快慢。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～2 min，10%A；2～3 min，10%～16%A；3～7.5 min，16%A；7.5～16 min，16%～52%A)；柱溫：40 ℃；流速：0.25 mL·min-1；檢測波長：350 nm；進樣量：1 μL。

2.3 對照品溶液的制備

取異葒草苷對照品、日當藥黃素對照品適量，精密稱定，加60%乙醇制成含異葒草苷19.776 μg·mL-1、日當藥黃素16.130 μg·mL-1的對照品溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取本品粉末(過四號篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率：500 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用60%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液備用。另取2.1項下冷浸法與熱浸法續濾液適量，濾過，取續濾液備用。

2.5 專屬性試驗

吸取對照品溶液、陰性對照溶液及供試品溶液，按2.2項下色譜條件分別測定。結果表明，陰性對照溶液在對照品溶液色譜峰相應位置無吸收，陰性對照無干擾，方法專屬性良好，見圖1。

注：A.對照品溶液；B.陰性對照溶液；C.供試品溶液；2.異葒草苷；3.日當藥黃素。圖1 淡竹葉對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液HPLC圖

2.6 線性關系考察

精密量取質量濃度為102.037 μg·mL-1的異葒草苷對照品母液以及質量濃度為102.292 2 μg·mL-1的日當藥黃素對照品母液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度。分別將稀釋后不同濃度的對照品溶液及對照品母液，按2.2項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(Y)，以進樣質量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，得回歸方程：異葒草苷Y1=10.952X1-0.752 7(r1=0.999 8)，質量濃度為1.020 4～102.037 0 μg·mL-1；日當藥黃素Y2=10.192X2-0.157 1，(r2=0.999 9)，質量濃度為1.022 9～102.292 2 μg·mL-1。表明異葒草苷、日當藥黃素在以上范圍內進樣質量濃度與峰面積線性關系良好。

2.7 精密度試驗

取S1樣品粉末1.0 g，按2.4項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件，重復進樣6次，測定峰面積，計算峰1、異葒草苷、日當藥黃素、峰4峰面積的RSD分別為1.93%、0.10%、0.45%、0.52%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗

取S1樣品粉末1.0 g，平行6份，按2.4項下方法分別制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件，進樣測定峰面積，計算峰1、異葒草苷、日當藥黃素、峰4峰面積的RSD分別為1.93%、2.02%、1.96%、2.48%，表明方法的重復性良好。

2.9 穩定性試驗

取S1樣品粉末1.0 g，按2.4項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 后按2.2項下色譜條件，進樣測定峰面積，計算峰1、異葒草苷、日當藥黃素、峰4峰面積的RSD分別為0.40%、1.70%、4.26%、1.22%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取已知指標成分含量的淡竹葉藥材，精密稱定，每組3份，按對照品加入量與所取供試品中待測定成分量分別為0.5∶1、1∶1、1.5∶1加入異葒草苷、日當藥黃素對照品，按2.2項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表2，回收率均為99.48%～105.22%，表明回收率良好。

表2 異葒草苷、日當藥黃素加樣回收率試驗結果(n=9)

3 結果

3.1 不同提取方法對淡竹葉浸出物得率及特征圖譜的影響

3.1.1不同提取方法浸出物的HPLC圖譜比較 不同提取方式及不同提取溶劑下的浸出物色譜圖見圖2，4個特征峰基本一致，但各峰的峰面積存在較大的差異。

注：1.淡竹葉藥材；2.冷浸法-水；3.冷浸法-50%乙醇；4.冷浸法-75%乙醇；5.冷浸法-95%乙醇；6.熱浸法-水；7.熱浸法-50%乙醇；8.熱浸法-75%乙醇；9.熱浸法-95%乙醇。圖2 不同提取方法浸出物與淡竹葉藥材(S11)HPLC 圖譜比較

3.1.2不同提取方法浸出物的HPLC 圖譜相似度分析 以淡竹葉藥材特征圖譜作為對照圖譜，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)分析各提取方法浸出物圖譜與藥材圖譜的相似度。

結果顯示，在水、95%乙醇提取下，浸出物圖譜與藥材圖譜之間的相似度為0.849～0.986，相對較低。而50%乙醇、75%乙醇提取下，其圖譜與藥材圖譜之間相似度在0.998以上，相似度較高，說明50%乙醇、75%乙醇適用于提取淡竹葉藥材中的有效成分。

3.1.3不同提取方法對浸出物中各評價指標的影響 取 S1樣品，按2.1和2.4項下所得的樣品，計算干燥品水溶性與醇溶性浸出物得率、異葒草苷含量、日當藥黃素含量，計算特征圖譜4個特征峰的總峰面積，根據過濾速度依次評分為2、4、4、5，結果見表3。

表3的結果顯示，相同提取溶劑下，浸出物得率，浸出物中異葒草苷含量、日當藥黃素含量，4個特征峰的總峰面積，熱浸法均高于冷浸法。相同的提取方式下，冷浸法浸出物得率順序為50%乙醇>水>75%乙醇>95%乙醇。熱浸法浸出物得率順序為50%乙醇>水>75%乙醇>95%乙醇；根據以上2個成分含量及總峰面積結果可知，50%乙醇和75%乙醇提取下，2種成分的含量和總峰面積比水和95%乙醇提取的高。

3.1.4提取方法的綜合評價 浸出物得率能反映藥材的提取程度，是評價中藥材質量的手段之一。異葒草苷、日當藥黃素均為淡竹葉中含量較高的黃酮類成分，異葒草苷具有較強的抑菌等作用，日當藥黃素是一種強的抗氧化劑，具有改善血液循環等功能，2種成分的含量可以體現成分在藥材中的質量水平[10-12]，特征圖譜可較全面反映藥材的質量[5]。在實際操作過程中，不同提取方式及不同提取溶劑的過濾速度存在較大差異，對實驗結果重現性造成影響。故以浸出物得率、2個成分含量、特征峰總峰面積及過濾速度作為浸出物提取方法優化的關鍵因素，每個關鍵因素均設為100%，并按照浸出物得率大小、成分含量高低、總峰面積大小、過濾速度得分，依次計算實際占比。通過層次分析法將浸出物得率、異葒草苷含量、日當藥黃素含量、總峰面積、過濾速度的權重比例設定為3、2、2、2、1，計算不同溶劑下淡竹葉浸出物提取方法的綜合分值，結果見表4。

冷浸法中水的浸出物得率占比=冷浸法中水的浸出物得率/(冷浸法浸出物得率之和+熱浸法浸出物得率之和)×100%

(1)

表3 淡竹葉不同提取方法浸出物中各指標結果

表4 淡竹葉不同提取方法浸出物的綜合評分結果

加權評分=浸出物得率加權系數×占比

(2)

總得分=浸出物得率加權評分+異葒草苷含量加權評分+日當藥黃色素含量加權評分+總峰面積加權評分+過濾速度加權評分

(3)

以上關鍵因素加權總得分結果顯示，熱浸法明顯優于冷浸法，熱浸法50%乙醇提取下淡竹葉浸出物總得分最高，綜合評分為173.4，故確定淡竹葉浸出物的提取方法為熱浸法50%乙醇提取。

3.2 淡竹葉浸出物質量標準的建立

按照優選的淡竹葉浸出物提取方法，對來源于主產區的12批淡竹葉藥材進行測定，平行測定 3次。結果見表5。

表5 12批淡竹葉浸出物得率

表5結果顯示，來自6個不同產地的淡竹葉其浸出物得率無較大差異。12批淡竹葉藥材浸出物得率的均值為(15.78±3.04)%，波動范圍為10.40%～20.04%。取淡竹葉浸出物范圍為均值加減1倍標準差，即12.73%～18.82%，12批淡竹葉浸出物中有2批不在此范圍內；取浸出物得率范圍為均值加減2倍標準差，即9.69%～21.87%，12批淡竹葉的浸出物均在此范圍內；取浸出物得率范圍為均值加減3倍標準差，即6.64%～24.91%，范圍較大。考慮此12批藥材的代表性及藥材質量的波動性，為嚴格控制淡竹葉藥材的浸出物，結合12批淡竹葉浸出物的波動范圍，最終確定淡竹葉浸出物得率為9.69%～21.87%。

4 討論

本實驗采用水和不同體積分數乙醇為溶劑，通過冷浸、熱浸2種方式進行提取。實驗結果顯示，在不同的提取條件下，浸出物中各指標結果均存在明顯差異。水提取的浸出物得率高，但指標成分的含量及特征峰總峰面積均最低，且過濾速度極慢、不易操作。95%乙醇提取的浸出物得率最低，提取出的有效成分較少，不利于藥材質量控制。相比于75%乙醇提取，50%乙醇提取所得的浸出物得率、日當藥黃素的含量及特征峰總峰面積高，且過濾速度均較快，故確定最佳提取條件為熱浸法50%乙醇溶液提取。在此基礎上，本次實驗共測定了12批淡竹葉藥材的浸出物得率，并根據12批淡竹葉浸出物得率制訂了淡竹葉藥材的浸出物范圍。結果顯示，不同產地藥材的浸出物得率差異無統計學意義，淡竹葉藥材的浸出物得率為9.69%～21.87%。

中藥包含的成分復雜多樣，除了對其主要成分進行含量測定外，還要通過指紋圖譜或特征圖譜等進行多組分的研究分析，從而更能體現藥材質量的整體性。通過浸出物得率并結合浸出物的指標成分含量及特征圖譜進行綜合分析，為淡竹葉浸出物的提取方法提供參考。