UPLC-Q-TOF-MS分析芍藥湯水煎液化學成分△

凌霄，李偉霞，王曉艷，趙婭，曹英杰

1.河南中醫藥大學 第一附屬醫院 藥學部/中藥臨床評價技術河南省工程實驗室，河南 鄭州 450001；2.呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，河南 鄭州 450001

芍藥湯是“金元四大家”之一劉完素所創的名方，首載于《素問病機氣宜保命集》，后世醫家皆推此方為治療濕熱痢疾之主方，目前臨床上仍被廣泛應用于濕熱下利腹瀉。芍藥湯全方由白芍Paeoniae Radix Alba、黃連Coptidis Rhizoma、當歸Angelicae Sinensis Radix、木香Aucklandiae Radix、檳榔Arecae Semen、甘草Glycyrrhizae Radix et Rhizoma、大黃Rhei Radix et Rhizoma、黃芩Scutellariae Ariae Radix、肉桂Cinnamomi Cortex組成，是中醫反治法的代表方劑。目前，國內外對芍藥湯的研究以臨床研究和藥理實驗研究為主，該方化學成分的研究集中在芍藥苷、小檗堿等成分的含量測定。有學者對芍藥湯開展了指紋圖譜研究，確定了其中13個共有峰，但僅對其中的3個峰進行了成分識別[1]。陳琳等[2]用高效液相色譜法測定了芍藥湯中鹽酸小檗堿的含量。但目前，芍藥湯整體化學輪廓仍不清晰，方中成分的定性、定量分析較為欠缺，嚴重制約了芍藥湯的深入研究和現代化研發。

隨著液質聯用技術的發展，超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜法(UPLC-Q-TOF-MS)在中藥成分分析中的應用越來越多。UPLC-Q-TOF-MS可給出化合物的準確相對分子質量及二級碎片信息，可以較準確地推測未知化合物的結構。因此，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS對芍藥湯水煎液中的化學成分進行了結構推測鑒定，共鑒定了33個成分，為芍藥湯藥效物質基礎研究、質量控制及現代化開發應用研究提供參考。

1 材料

1.1 藥材

實驗所用藥材均購自張仲景大藥房，由河南中醫藥大學第一附屬醫院藥檢室施鈞瀚副主任藥師鑒定分別為毛茛科植物芍藥PaeoniatactiloraPall.的干燥根、毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖、傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根、菊科植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根、棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖、蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根和根莖、唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根和樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥樹皮。

1.2 試劑

對照品芍藥苷(純度：96.8%，批號：110736-201842)、大黃素甲醚(純度：99.0%，批號：110758-201616)、黃芩苷(純度：95.4%，批號：110715-201821)、漢黃芩苷(純度：98.5%，批號：112002-201702)、漢黃芩素(純度：99.0%，批號：111514-201706)、甘草酸二銨(純度：93.2%，批號：101050-201101)、甘草苷(純度：95.0%，批號：111610-201607)、鹽酸小檗堿(純度：85.9%，批號：110713-201814)、鹽酸藥根堿(純度：89.5%，批號：110733-201609)均購于中國食品藥品檢定研究院；對照品白芍苷(純度：99.0%，批號：16051601)購于成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)購于德國Merck公司；甲酸(色譜純，Tedia公司)；實驗用水為哇哈哈蒸餾水。

1.3 儀器

UPLC-Q-TOF-MS系統：ACQUITY-UPLC型高效液相色譜儀、XEVO-G2XSQTOF飛行時間質譜儀，配有電噴霧離子源(ESI，美國Waters公司)。

2 方法

2.1 對照品溶液制備

分別稱取芍藥苷、大黃素甲醚、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、甘草酸二銨、甘草苷、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、白芍苷約1 mg，精密稱定，用甲醇溶解，配制至質量濃度為1 mg·mL-1的對照品母液。取上述對照品母液適量，用甲醇稀釋為0.02 mg·mL-1的溶液，備用。

2.2 供試品溶液制備

按《素問病機氣宜保命集》中芍藥湯的各味藥配比[3]，采用臨床使用中的煎煮方法，稱取白芍30 g、黃連15 g、當歸15 g、木香6 g、檳榔6 g、甘草6 g、大黃9 g、黃芩15 g、肉桂5 g至圓底燒瓶中，加水浸泡30 min后，第1次加6倍量水(約650 mL)，煎煮40 min后，2層紗布濾過，殘渣加4倍量水(約400 mL)，煎煮30 min后，兩層紗布濾過，合并2次濾液，減壓濃縮至1 g·mL-1(以生藥量計)。取其中2 mL濃縮液，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，超聲30 min，15 000×g離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，作為供試樣品，待測。

2.3 液相色譜分析條件

采用Waters ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%～15%B；5～10 min，15%～20%B；10～20 min，20%B；20～35 min，20%～25%B；35～40 min，25%～60%B；40～50 min，60%～80%B；50～51 min，80%～100%B；51～55 min，100%B；55～60 min，100%～10%B)；體積流量0.4 mL·min-1，柱溫25 ℃；進樣量4 μL。

2.4 Q-TOF-MS分析條件

電噴霧離子源(ESI)，正、負離子掃描模式；毛細管電壓2500 V；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣溫度250 ℃；脫溶劑氣體積流量600 L·h-1；源溫度100 ℃；錐孔氣體積流量50 L·h-1；亮氨酸-腦啡肽溶液在線校正(正離子模式mz556.277 1，負離子模式mz554.261 5)；掃描范圍mz：100～1000，掃描方式為全掃描。采用Waters UNIFI軟件對采集的數據進行處理。

3 結果

3.1 化學成分分析

共鑒定33個化學成分，其中化合物1、2、5～7、10、11為萜類化合物，化合物15、29、32為蒽醌類化合物，化合物3、9、13、23、25～28、30、31為黃酮類化合物，化合物4、17～22、24為生物堿類化合物，芍藥湯水煎液樣品在正、負離子模式下的總離子流圖見圖1。主要成分對照品及樣品質譜圖見圖2～3。

注：A.正離子模式；B.負離子模式。圖1 芍藥湯水煎液的正、負離子模式下的總離子流圖

注：A.白芍苷；B.大黃素甲醚；C.甘草苷；D.甘草酸；E.漢黃芩苷；F.漢黃芩素；G.黃連堿；H.黃芩苷；I.芍藥苷；J.小檗堿；K.藥根堿；圖3同。圖2 芍藥湯水煎液中主要成分對照品質譜圖

圖3 芍藥湯水煎液樣品中主要成分質譜圖

3.2 結構鑒定

3.2.1萜類化合物 芍藥中的化合物多為萜類化合物，本研究從芍藥湯水煎液中鑒定了7個萜類化合物，下面主要解析代表性成分芍藥苷和白芍苷的結構鑒定過程。化合物7在負離子模式下得到甲酸加和離子峰mz525.160 3[M+HCOO]-，mz449[M+HCOO-C3H8O2]-，脫去1分子苯甲酸乙酯和水形成特征碎片離子mz327[M+HCOO-C3H8O2-H2O-HCOO]-，脫去糖基形成特征碎片離子mz165[M+HCOO-C6H11O5-C10H13O4]-，再脫去羧基后形成特征碎片離子mz121[M+HCOO-C6H11O5-C10H13O4-CO2]-，結合文獻報道[3-7]和與對照品對比(圖2～3)，確定化合物7為芍藥苷。

化合物5在負離子模式下得到甲酸加和離子峰mz525.110 2[M+HCOO]-、準分子離子峰mz479[M-H]-，推測其分子式為C24H30O13，脫去1分子苯甲酸，形成特征碎片離子mz357[M+HCOO-C7H7O2-HCOO]-，脫去1個糖苷形成特征碎片離子mz121[M+HCOO-C6H11O5-C10H12O4-HCOO]-，查閱文獻[4-8]，與白芍苷的質譜裂解規律一致，與對照品對比后(圖2～3)，確定化合物5為白芍苷。芍藥湯中代表性萜類成分質譜裂解規律見圖4。

3.2.2蒽醌類成分 大黃中含有大量蒽醌類成分。本研究從芍藥湯水煎液中鑒定了3個蒽醌類成分，下面主要解析代表性成分大黃素甲醚的結構鑒定過程。在負離子模式下，化合物29的準分子離子峰為mz283.110 2[M-H]-，推斷其分子式為C16H12O5，在質譜裂解過程中，脫去甲基，產生特征碎片離子mz268[M-H-CH3]-，查閱文獻[9-11]，與大黃素甲醚的主要裂解規律一致，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物29為大黃素甲醚。大黃素甲醚質譜裂解規律見圖5。

圖4 芍藥湯中代表性萜類成分質譜裂解規律

圖5 芍藥湯中代表性蒽醌類成分大黃素甲醚質譜裂解規律

3.2.3黃酮類化合物 黃芩和甘草中的化合物多為黃酮類化合物，本研究從芍藥湯水煎液中鑒定出10個黃酮類成分，下面主要解析4個代表性成分的結構鑒定過程。在負離子模式下，化合物25的準分子離子峰為mz445.077 0[M-H]-，推斷其分子式為C21H18O11，誤差為-0.4×10-6。在質譜裂解過程中，其準分子離子峰脫去葡萄糖羧基產生特征碎片離子mz269[M-gluA-H]-，特征碎片mz269，繼續脫去CO，產生特征碎片離子mz239[M-gluA-CO-H]-。查閱文獻[11-13]和對照品比對后(圖2～3)，發現與黃芩苷的主要裂解特征一致，確定化合物25為黃芩苷。

在負離子模式下，化合物28的準分子離子峰為mz459.112 3[M-H]-，推斷其分子式為C22H20O11。在裂解過程中，其準分子離子峰脫去葡萄糖羧基產生特征碎片離子mz283[M-gluA-H]-，準分子離子峰脫去葡萄糖羧基和甲基產生碎片離子mz268[M-gluA-CH3-H]-，與文獻報道的裂解特征一致[11-12]，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物28為漢黃芩苷。

在正離子模式下，化合物30的準分子離子峰為mz285.100 1[M+H]+，推斷其分子式為C16H12O5，其準分子離子峰脫去甲基，產生特征碎片離子mz270[M-CH3-H]+，該裂解特征和文獻報道一致[12-13]，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物30為漢黃芩素。

在正離子模式下，化合物8的準分子離子峰為mz419.251 4[M+H]+，其準分子離子峰脫去葡萄糖基和樹膠醛糖基得到特征離子碎片mz271[M+H-glucosyl-arabinosyl]+，負離子質譜中捕捉到準分子離子峰417.119 0[M-H]-，推測分子式為C21H22O9，結合文獻報道[14-15]，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物8為甘草苷。

在負離子模式下，化合物31的準分子離子峰為mz821.203 6[M-H]-，其準分子離子峰脫去葡萄糖醛酸基，得到特征離子碎片mz645[M-gluA-H]-，脫去2個葡萄糖醛酸基，得到特征離子碎片mz469[M-gluA×2-H]-，查閱文獻[15-16]，與甘草酸主要裂解特征一致，與甘草酸對照品比對后(圖2～3)，確定化合物31為甘草酸。

由上述實驗結果可知，含葡萄糖醛酸-O-苷類化合物通常會產生失去葡萄糖醛酸基(mz176)的特征碎片離子。芍藥湯中代表性黃酮類成分質譜裂解規律見圖6。

3.2.4生物堿類化合物 黃連中的主要成分為生物堿類成分，本研究從芍藥湯水煎液中鑒定了8個生物堿類成分，下面主要解析3個代表性成分的結構鑒定過程。化合物22的準分子離子峰為mz336.012 1，黃連中的生物堿為季胺型生物堿，其準分子離子峰即為相對分子質量，因此推測化合物22的分子式為C20H17NO4，準分子離子峰脫去甲基后進一步脫去與N相連的H，形成特征碎片離子mz320[M-CH4]+，準分子離子峰脫去1個甲基和CO后形成特征碎片離子mz291[M-CH3-CO]+，查閱文獻[16-18]，與小檗堿的主要裂解特征一致，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物22為小檗堿，質譜裂解規律見圖7。

化合物21的準分子離子峰為mz338.021 6，推測其分子式為C20H19NO4，其準分子離子峰脫去甲基后脫去與N相連的H，形成特征碎片離子mz322[M-CH4]+，碎片離子mz322[M-CH4]+脫去CO，形成特征碎片離子mz294[M-CH4-CO]+。上述裂解與文獻報道藥根堿的主要裂解特征一致[16-18]，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物21為藥根堿。

化合物17的準分子離子峰為mz320.142 2[M]+，推測其分子式為C19H13NO4，脫去CH2O后形成特征碎片離子mz290[M-CH2O]+，與文獻中黃連堿裂解規律一致[16-18]，與對照品比對后(圖2～3)，確定化合物17為黃連堿。芍藥湯水煎液主要化學成分鑒定結果見表1。

圖6 芍藥湯中代表性黃酮類成分質譜裂解規律

圖7 芍藥湯中小檗堿質譜裂解規律

表1 芍藥湯水煎液主要化學成分鑒定結果

續表1

4 討論

芍藥湯全方由9味中藥組成，化學成分復雜，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術對芍藥湯水煎液主要化學成分進行鑒定。鑒別出的主要化合物來源于芍藥、黃連、黃芩、大黃、當歸和甘草，方中肉桂、木香中的揮發性成分較少鑒別，其原因可能是提取方式的選擇和藥物用量大小。由于臨床中芍藥湯的使用方式以水煎服為主，為了更加準確地了解芍藥湯臨床實際應用時的有效成分，本研究中湯液的制備方式與臨床實際應用保持一致，采用水煎煮，而木香、肉桂中的標志性成分揮發性較強，在煎煮中容易損失，且木香、肉桂在全方中用量較小，因此未鑒別出木香、肉桂中的大量揮發性成分，后續需要針對芍藥湯中的揮發性成分專門設計考察提取工藝，對方中揮發性成分進行更加完善的分析。

本研究的色譜分離結果顯示，部分色譜峰沒有完全分離，但是利用質譜高分辨的特點，可以通過相對分子質量的差異，準確區分不同化合物，通過準分子離子峰和二級質譜產生的特征性碎片離子，可對芍藥湯水煎液進行定性分析。但本研究仍存在許多不足，部分藥物的部分成分未成功鑒別，而從總離子流圖中可看出，仍有部分響應值較高的峰，其質量數、碎片離子數據未能與現有文獻報道匹配，提示芍藥湯水煎液中仍有許多未知成分，需要進一步研究探索。

本研究首次采用UPLC-TOF-MS鑒定芍藥湯水煎液中33個化學成分，該法可以簡便、快速地對方劑中化學成分進行定性研究，有利于深入研究芍藥湯藥效物質基礎。此外，芍藥湯中的揮發性成分在傳統的水煎法中損失較大，對芍藥湯中揮發性成分需要專門設計提取工藝，以便進一步的鑒別分析。