基于SNP雙峰法的人參花 西洋參花 三七花及其混合物的快速鑒定△

曹佩，王剛，白璇姣，韓建萍

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 國家中醫藥管理局中藥資源保護重點研究室，北京 100193

人參花、西洋參花和三七花分別來自于人參PanaxginsengC.A.Mey.、西洋參P.quinquefoliusL.和三七P.notoginseng(Burk.)F.H.Chen，近年來逐漸被作為“花茶”應用于日常保健。現代藥理學研究表明，人參花的主要有效成分為多糖和人參皂苷[1-2]，可以有效地提高人體免疫力、清除自由基，具有重要的應用價值[3]。西洋參花多糖可以調節巨噬細胞活性，是保健品和食品理想的原材料[4]。三七花中含有大量皂苷類、總酚類和黃酮類化合物及礦物質，可以抑制人體內自由基的生成，也逐漸被作為營養添加劑應用于食品和藥品中[5]。但是三者均以總花梗短、小花團聚為特征，外觀可分辨度低，在干燥之后作為花茶更加難以辨認。此外，化學成分的相似性也從一定層面上增加了其鑒定難度。孟祥松等[6]采用高效液相色譜法(HPLC)對人參花、西洋參花和三七花鑒別時發現，人參花中獨有人參皂苷Rg1峰，三七花中獨有人參皂苷Rb1峰，除此之外，在化學成分上無明顯差異。當出現人參花與西洋參花、西洋參花與三七花混雜時，化學方法難以鑒定真偽。因此，運用傳統鑒別方法對這3種花蕾進行準確鑒別難度極大。

DNA條形碼分子鑒定方法是基于分子生物學和生物信息學，結合不同物種基因組中一段公認且相對較短的DNA序列的高效物種鑒定方法，已成功應用于植物、動物和部分深加工產品的鑒定中[7-9]。對于植物而言，DNA條形碼分子鑒定體系主要包括核心鑒定序列內轉錄間隔區2(ITS2)和輔助鑒定序列psbA-trnH[10]。ITS2序列具有擴增效率高、種內較為保守、種間變異大等優點[11]，已成功應用于眾多藥用植物的鑒定中。研究發現，ITS2條形碼聚合酶鏈式反應(PCR)擴增成功率(93.8%)高于psbA-trnH(92.8%)和ITS(42.3%)，且在4800余種、6600多份的植物樣本中，ITS2(92.7%)條形碼的鑒定效率高于psbA-trnH(67.6%)。在ITS2條形碼的基礎上，利用單核苷酸多態性(SNP)位點可實現近緣物種間的鑒別[11]。根據本課題組前期研究結果，利用人參和西洋參的SNP位點可以準確鑒定出人參和西洋參。當人參和西洋參以1∶19混合時，在SNP處可出現雙峰，且峰高[西洋參的主峰鳥嘌呤(G)/腺嘌呤(A)高于人參的主峰A/G)]可大致反映摻雜比例[12]。

本研究收集市售人參花6份、西洋參花9份和三七花7份，基于ITS2序列對其進行鑒定，并建立了快速鑒別兩兩混合物的SNP雙峰法，以期為市場上人參花、西洋參花和三七花的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 試藥

人參花、西洋參花和三七花樣品購買于不同藥材市場及道地產區，共計22份。其中，人參花 6份、西洋參花9份、三七花樣品7份(表1和圖1)。由中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所林余霖研究員對人參花、西洋參花和三七花進行形態學鑒定，分別為人參PanaxginsengC.A.Mey.、西洋參P.quinquefoliusL.和三七P.notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥花蕾。

DP316植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；2×Taq聚合酶鏈式反應(PCR) Master Mix(北京艾德萊生物科技有限公司)；引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

1.2 儀器

MM400型冷凍混合球磨儀(德國Retsch公司)；LUX-24型數顯恒溫水浴鍋(北京陸希科技有限公司)；846-x-070-301型PCR儀(德國Biometra公司)；移液器(德國Eppendorf公司)；D-37250型冷凍離心機(德國Sigma公司)；GelDoc XR+IMAGELAB型凝膠成像儀(德國Bio-Rad公司)。

表1 西洋參花、三七花、人參花樣品信息

注：A.人參花；B.西洋參花；C.三七花；圖2同。圖1 人參花、西洋參花和三七花

2 方法

2.1 DNA提取

取人參花、西洋參花和三七花樣品20 mg；對于混合樣品，將已鑒定為正品的人參花、西洋參花和三七花打粉，過二號篩，以2∶8、2∶10、8∶2和10∶2兩兩均勻混合，取混合后的植物粉末20 mg。采用球磨儀研磨2 min(30 Hz)。使用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。研磨后的樣品加入裂解液后，將其置于65 ℃水浴2 h，用-20 ℃異丙醇沉淀DNA，其余步驟參照試劑盒說明書進行[13]。

2.2 PCR擴增

ITS2引物為2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。將引物稀釋至2 μmol·μL-1，擴增DNA模板。PCR體系為DNA模板2 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、引物2F/3R(2.5 μmol·L-1)各1.0 μL、ddH2O 8.5 μL，共25 μL。反應程序為94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s，40個循環；72 ℃孵育10 min，純化后的PCR產物送至中國農業科學院重大工程實驗室進行測序。

2.3 數據分析

利用CodonCode Aligner V 9.0.1(CodonCode Co.)軟件進行序列校對、拼接，去除低質量序列及引物區。基于隱馬爾可夫模型(Hidden Markov model，HMM)去除5.8 S rRNA和28 S rRNA基因區。使用“中藥材DNA條形碼鑒定系統”(www.tcmbarcode.cn)和美國國家生物技術信息中心(NCBI)的BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)功能完成人參花、西洋參花和三七花的物種鑒定。采用MEGA 7.0軟件對測序得到的ITS2序列和GenBank下載的人參屬ITS2序列進行多序列比對。

3 結果

3.1 人參花、西洋參花和ITS2 2F/3R三七花SNP位點的篩選

所有樣品均采用ITS2 2F/3R引物進行擴增，擴增成功率為100%，ITS2序列大小為230 bp，具體信息見圖2，共獲得了22條ITS2序列。BLAST結果表明，所有市售樣品均為正品。采用MEGA 7.0將獲得的序列進行比對，比對結果表明，在19～47 bp處，存在人參花、西洋參花和三七花的穩定遺傳變異。在該區間內，人參特有的序列片段為5′-AACCCATCACTCCCTTGCGGGAGTTGAGG-3′，與人參相比，西洋參呈現2個變異位點[分別是32位胸腺嘧啶(T)和43位胞嘧啶(C)]，三七出現4個變異位點(分別是28位T、34位C、43位C和46位T)，見表2。

圖2 人參花、西洋參花和三七花的ITS2序列特征

表2 人參花、西洋參花和三七花ITS2區域5個穩定的SNP位點

3.2 人參花、西洋參花和三七花ITS2數據庫的建立及SNP位點保守性評估

為了評價該區間在物種鑒定方面的準確性和特異性，從GenBank下載了109條人參、西洋參和三七的ITS2序列，并采用MEGA 7.0進行比對(圖3)。比對結果表明，在這28 bp內，3個物種間存在穩定的變異位點。其中，人參和西洋參存在2個變異位點，人參和三七存在4個變異位點，西洋參和三七存在4個變異位點。因此，在19～47 bp內的SNP位點可應用于人參花、西洋參花和三七花的物種鑒定。

3.3 基于SNP雙峰法的混合物檢測

將人參花和西洋參花、人參花和三七花、西洋參花和三七花粉末以2∶8、2∶10、8∶2和10∶2人工混合，混合物的DNA均采用ITS2 2F/3R引物進行擴增，擴增成功率為100%。以PCR產物的測序峰圖對混合粉末的物種組成進行了檢測。

如圖4所示，人參的SNP位點(32、43 bp)處主峰為C/T(圖4A)，西洋參在該處的主峰為T/C(圖4B)，混合物僅在SNP位點出現雙峰(圖4C～F)。當人參花和西洋參花以2∶8混合時，BLAST分析顯示該樣品為人參。此時，在32 bp處，西洋參花的主峰T略高于人參花的主峰C，在43 bp處，人參花的主峰T略高于西洋參花的主峰C(圖4C)，表明該樣品為人參花和西洋參花的混合物。當人參花和西洋參花以2∶10混合時，BLAST分析顯示該樣品為西洋參。此時，西洋參花的主峰T/C高于人參花的主峰C/T(圖4D)，表明該樣品為摻雜有人參花的西洋參花。當人參花和西洋參花以8∶2混合時，BLAST分析顯示該樣品為人參。此時，人參花的主峰C/T高于西洋參花的主峰C/T(圖4E)，表明該樣品為摻雜有少量西洋參花的人參花。當人參花和西洋參花以10∶2混合時，BLAST結果顯示該樣品為人參。此時，人參花的主峰C/T遠高于西洋參花的峰T/C(圖4F)，表明該樣品為摻雜有微量西洋參花的人參花。

圖3 人參、西洋參和三七的ITS2序列片段比對結果

注：A.人參花；B.西洋參花；C.人參花和西洋參花2∶8混合；D.人參花和西洋參花2∶10混合；E.人參花和西洋參花8∶2混合；F.人參花和西洋參花10∶2混合。圖4 人參花、西洋參花和兩花混合物雙峰圖

如圖5所示，人參的SNP位點(28、34、43、46 bp)處主峰為C/T/T/G(圖5A)，三七在該處的主峰為T/C/C/T(圖5B)，混合物僅在SNP位點處出現雙峰(圖5C～F)。當人參花和三七花以2∶8混合時，BLAST分析顯示該樣品為三七。此時，在28、34、46 bp處，三七花的主峰T/C/T略高于人參花的主峰C/T/G，在43 bp處，人參花的主峰略高于三七花的主峰C(圖5C)，表明該樣品為摻雜有人參花的三七花。當人參花和三七花以2∶10混合時，BLAST分析顯示該樣品為三七。此時，在28、34、46 bp處，三七花的主峰T/C/T高于人參花的主峰C/T/G，在43 bp處，人參花的主峰高于三七花的主峰C(圖5D)，表明該樣品為摻雜有少量人參花的三七花。當人參花和三七花以8∶2混合時，BLAST分析顯示該樣品為人參。此時，人參花的主峰C/T/T/G高于三七花的主峰T/C/C/T(圖5E)，表明該樣品為摻雜有少量三七花的人參花。當人參花和三七花以10∶2混合時，BLAST分析顯示該樣品為人參。此時，人參花的主峰C/T/T/G遠高于三七的主峰T/C/C/T(圖5F)，表明該樣品為摻雜有微量三七花的人參花。

注：A.人參花；B.三七花；C.人參花和三七花2∶8混合；D.人參花和三七花2∶10混合；E.人參花和三七花8∶2混合；F.人參花和三七花10∶2混合。圖5 人參花、三七花和兩花混合物雙峰圖

如圖6所示，西洋參花在28、32、34、46 bp處主峰為C/T/T/G(圖6A)，三七花在該處的主峰為T/C/C/T(圖6B)，混合物僅在SNP位點處出現雙峰(圖6C～F)。當西洋參花和三七花以2∶8混合時，BLAST分析顯示該樣品為三七，此時，三七花主峰T/C/C/T高于西洋參花的主峰C/T/C/G(圖6C)，表明該樣品為摻雜有少量西洋參花的三七花。當西洋參花和三七花以2∶10混合時，BLAST分析顯示該樣品為三七。此時，在34 bp處，三七花主峰C遠高于西洋參花的主峰T(圖6D)，表明該樣品為摻雜有微量西洋參花的三七花。當西洋參花和三七花以8∶2混合時，BLAST分析顯示該樣品為西洋參。此時，在28、34、46 bp處，西洋參花的主峰C/T/G高于三七花的主峰/T/C/T，在32 bp處，三七花的主峰C高于西洋參花的主峰T(圖6E)，表明該樣品為摻雜有三七花的西洋參花。當西洋參花和三七花以10∶2混合時，BLAST分析顯示該樣品為西洋參。此時，西洋參花的主峰C/T/T/G遠高于三七花的主峰/T/C/C/T(圖6F)，表明該樣品為摻雜有少量三七花的西洋參花。

注：A.西洋參花；B.三七花；C.西洋參花和三七花2∶8混合；D.西洋參花和三七花2∶10混合；E.西洋參花和三七花8∶2混合；F.西洋參花和三七花10∶2混合。圖6 人參花、三七花和兩花混合物雙峰圖

3.4 基于SNP雙峰法對市售商品BLAST結果的深度驗證

鑒于混合物的BLAST分析結果與實際結果存在差異，對采用BLAST分析的22份花類商品進行了深度分析。峰圖顯示(圖7)，樣品S1和樣品S7在32、43 bp處出現雙峰，且T/C峰高于C/T峰，表明樣品1和樣品7為摻雜有少量人參花的西洋參花。此外，其余20份樣品在SNP處均為單峰，表明均為正品。

注：S6.正品西洋參花；S1、S7.摻雜有少量人參花的西洋參花。圖7 西洋參花樣品雙峰圖

4 討論

4.1 SNP雙峰法在花類混合物鑒定中的必要性

人參花、西洋參花和三七花不僅可以作為花茶飲用，同時也是很多保健品的原材料。但是，由于此3類物種的相似性和市場監管的缺失，有必要開發一種新的鑒別方法對該類產品市場進行規范化的引導。

Chen等[12]發現，人參和西洋參的遺傳距離較小(0～0.02)，在其ITS2區域可以檢測出穩定的SNP位點，認為ITS2可應用于人參和西洋參的鑒別。Liu等[14]報道了一種基于ITS2序列的西洋參專屬分子身份證，應用該分子身份證不僅可實現西洋參與其混偽品的鑒別，還可實現深加工的中成藥鑒別。但是，目前對于該類產品多集中于混偽品的研究，缺乏對于混合物行之有效的鑒定方法。基于以上條形碼鑒定方法在物種鑒定上的準確性，考慮將該方法引入到花類產品以及花類混合物的鑒定中。本研究中發現了可應用于人參花、西洋參花和三七花物種鑒定的SNP位點，不僅可以準確鑒定這3種花的真偽，還可以對混合粉末的組成做出判斷。

4.2 SNP雙峰法是BLAST分析的補充手段

在本研究中，SNP雙峰法可準確、迅速、直觀地對近緣物種進行鑒定。通過人工混合不同比例的人參花和西洋參花、人參花和三七花、西洋參花和三七花來驗證該方法的準確性。通過對混合物ITS2序列的BLAST分析法和SNP雙峰法的分析結果進行對比，發現SNP雙峰法是物種鑒定的靈敏手段。當西洋參花和三七花以2∶8混合時，BLAST結果顯示該樣品為三七，此時，三七花主峰T/C/C/T高于西洋參花的主峰C/T/C/G，表明該樣品為摻雜有西洋參花的三七花。Gao等[15]發現，即使在混合比例低至6%時，通過分析SNP位點的雙峰仍可以清楚地檢測到金銀花和山銀花的混合物。同樣，在本研究中，通過分析SNP位點的雙峰，可以有效地鑒定人參花和西洋參花、人參花和三七花、西洋參花和三七花的混合物。

在此基礎上，對本研究中的22份商品花類進行了深度鑒定。鑒定結果表明，22份商品中，20份商品為正品。BLAST分析結果表明，基于DNA條形碼序列判斷22份商品均為正品。而SNP雙峰法的驗證結果顯示，所有的人參花和三七花均為正品，但9份西洋參花中有2份商品在SNP位點處出現雙峰，且西洋參花的主峰T/C高于人參花的主峰C/T，據此推斷這2份樣品為摻雜有少量人參花的西洋參花。因此，SNP雙峰法可以作為BLAST分析的補充手段，用于物種的鑒定。

4.3 SNP雙峰法為花類市場監管提供有效的技術支撐

近年來，DNA條形碼技術已經廣泛應用于中藥的物種鑒定(包括根類、種子類、葉類和花)[16-19]。這些結果表明，DNA條形碼是高效的物種鑒定工具。本研究在DNA條形碼的基礎上，成功利用SNP雙峰法對市售人參花、西洋參花和三七花進行了鑒定，且實現了3種花類兩兩混合物的鑒定。因此，利用SNP雙峰法可實現人參花、西洋參花和三七花的鑒定，同時可為花類產品的檢測提供參考。