阿司匹林通過抑制STAT3磷酸化下調MCL-1和VEGF mRNA和蛋白表達促進膽囊癌細胞凋亡、抑制增殖

李皇保，周俊，趙鳳慶，吳曉俊，閔捷

（嘉興市第一醫院/嘉興醫學院附屬第一醫院 肝膽外科，浙江 嘉興 314000）

膽囊癌起病隱匿、發展迅速、預后較差[1]。雖然手術可以改善患者，但仍不理想[2]。在現有治療方案的基礎上探討膽囊癌發展的分子機制，尋找潛在的化學治療靶點具有重要意義。阿司匹林是非甾體抗炎藥，國內外多項研究提示其可改善肝癌[3]、結直腸癌[4]、乳腺癌[5]及胰腺癌[6]的預后，可以降低膽囊癌的發病風險[7]。但是阿司匹林在膽囊癌中的具體作用機制目前國內外相關報道很少。本研究旨在通過阿司匹林干預膽囊癌細胞株GBC-SD中Janus酪氨酸激酶/信號轉導和轉錄激活因子3（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3，JAK/STAT3）信號通路中關鍵分子STAT3的表達水平及磷酸化水平，觀察阿司匹林對膽囊癌細胞凋亡、增殖的影響，以及膽囊癌細胞凋亡、增殖與STAT3、磷酸化STAT3（pSTAT3）、髓細胞白血病因子-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達的關系，探討阿司匹林對膽囊癌細胞株凋亡、增殖影響的潛在分子機制，為膽囊癌的化學治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料

GBC-SD細胞系（中科院細胞庫），1640 培養基（Gibco公司），10%胎牛血清（Biowest），DMSO、噻唑藍（MTT），阿司匹林（Sigma），0.25%胰酶-EDTA（Procell），VEGF抗體、MCL-1抗體（Sigma），STAT3抗體、磷酸化STAT3抗體（Abcam），Trizol液（Biosharp），逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（VAZYME），凋亡試劑盒（eBioScience），STAT3激動劑（Colivelin，MedChemExpress）。

1.2 細胞培養

復蘇后的細胞于含10%胎牛血清的1640培養液中培養（37 ℃、5% CO2）。當細胞長滿培養皿80%～90%，0.25%胰酶消化細胞，用新的培養基將細胞重懸，將細胞按適當比例傳代，約2～3 d傳代1次。

1.3 細胞增殖檢測

MTT法。取對數生長期細胞，接種在96孔不含胎牛血清的平板中，每孔80 μL細胞懸液，細胞數1 500，并在37 ℃環境中培養24 h，然后各組分別加入空白溶劑、1 mmol/L、3 mmol/L和5 mmol/L阿司匹林溶液20 μL，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下繼續培養。培養48 h后每孔加MTT貯存液10 μL，繼續孵育4 h，棄細胞上清液后每孔加入10 μL的DMSO，10 min后采用全自動酶標儀檢測570 nm處的各孔吸光度（A）值，5 mmol/L組未處理的細胞繼續培養至72 h，棄細胞上清液后每孔加入10 μL的DMSO，10 min后采用全自動酶標儀檢測570 nm處的各孔吸光度（A）值，按公式計算：細胞存活率（%）=藥物組A值/對照組A值×100%。

1.4 GBC-SD細胞凋亡檢測

流式細胞術。細胞培養同前，待對照組（空白對照，無阿司匹林）及實驗組（阿司匹林，5 mmol/L）6孔板細胞生長至覆蓋率約為70%時誘導凋亡，離心、洗滌，加入10 μL Annexin V-APC染色，室溫避光10～15 min，上機檢測，分析結果。

1.5 MCL-1、VEGF和STAT3的mRNA檢測

Real-time PCR。根據GBC-SD細胞生長速度將其按400 000細胞每孔的細胞密度接種于6孔細胞板中，每孔接種2 mL細胞懸液，37 ℃、5% CO2培養箱，孵育過夜。處理組加入阿司匹林，對照組加入等體積無水乙醇，阿司匹林濃度為1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L，乙醇濃度為1%。細胞板放回培養箱，避光孵育6 h。結束孵育后，去除貼壁細胞上清，收集細胞置于1 mL Trizol試劑置于-80 ℃中保存。按照Trizol法提取RNA，然后逆轉錄成cDNA，最后PCR檢測MCL-1、VEGF和STAT3 的mRNA表達，反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，40個循環。采用相對定量法（2-△△Ct法）計算mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.6 STAT3、pSTAT3、MCL-1和VEGF的蛋白檢測

Western blotting。細胞培養同前。為檢測阿司匹林濃度對以上蛋白的表達影響，分組設置為（A）空白對照組、阿司匹林濃度為1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L組；為檢測STAT3激動劑對以上蛋白表達的影響，分組設置為（B）空白對照組、阿司匹林組（5 mmol/L）、激動劑+空白組、激動劑+阿司匹林組（5 mmol/L）。藥物處理后細胞板放回培養箱，避光孵育48 h。結束孵育后，去除貼壁細胞上清，收集細胞，經細胞裂解液裂解后提取各組細胞的總蛋白，灌膠，電泳，轉膜，TBST洗膜，共3次，最后顯影。

1.7 統計學分析

MTT、流式細胞檢測術及PCR結果使用Graph-Pad Prism軟件進行統計分析及作圖，各組別間的比較采用t檢驗（2組間比較）或單因素方差分析（3組以上比較）；Western blotting結果比對電泳條帶灰度，對每條條帶重復測量3次，根據目標蛋白與GAPHD蛋白的相對灰度值計算P值。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 阿司匹林對GBC-SD細胞增殖的影響

48 h時空白對照、1 mmol/L、3 mmol/L和5 mmol/L 4個濃度點下各孔細胞存活率分別為（100.00±1.35）%、（95.17±3.97）%、（87.40±5.59）%、（81.42±2.55）%。結果發現，阿司匹林對GBC-SD的增殖抑制呈濃度依賴，與對照組相比差異有統計學意義（1 mmol/Lvs空白對照：t=-1.59，P=0.32；3 mmol/Lvs空白對照：t=-4.15，P＜0.05；5 mmol/Lvs空白對照：t=-6.12，P＜0.05；組間方差分析：F=14.68，P＜0.001）。將未經處理的阿司匹林5 mmol/L組繼續培養至72 h，同前處理后檢測吸光度值為（37.17±0.49）%，與48 h組的阿司匹林處理組進行比較，結果證明阿司匹林對膽囊癌細胞株增殖抑制呈時間依賴，差異有統計學意義（t=29.5，P＜0.001）。見圖1。

圖1 阿司匹林抑制GBC-SD細胞的增殖

2.2 阿司匹林對GBC-SD細胞凋亡的影響

對照組細胞凋亡比為（1.40±0.11）%，5mmol/L阿司匹林組的細胞凋亡比為（8.32±0.16）%，差異有統計學意義（t=-62.062，P＜0.001），提示阿司匹林促進膽囊癌GBC-SD細胞凋亡。見圖2。

2.3 阿司匹林對膽囊癌GBC-SD細胞中MCL-1、VEGF和STAT3 mRNA表達的影響

RT-PCR結果發現，阿司匹林可下調MCL-1[空白對照：1.40±0.52；1 mmol/L：1.04±0.27vs空白對照，t=-2.39，P=0.11）；3 mmol/L：0.96±0.13vs空白對照，t=-3.09，P＜0.05）；5 mmol/L：0.81±0.57vs空白對照，t=-4.20，P＜0.05）]、VEGF[空白對照：3.85±0.53；1 mmol/L：3.82±1.09vs空白對照，t=-0.04，P=0.99）；3 mmol/L：2.11±0.78vs空白對照，t=-2.90，P＜0.05）；5 mmol/L：1.19±0.82vs空白對照，t=-4.85，P＜0.05）]mRNA的相對表達，差異與對照組相比有統計學意義（MCL-1，F=6.30，P＜0.05；VEGF，F=11.11，P＜0.05）。與對照組相比，阿司匹林對STAT3（空白對照：1.51±0.17、1 mmol/L：1.48±0.28、3 mmol/L：1.48±0.29、5 mmol/L：1.56±0.26）mRNA的表達的影響無顯著差異（F=0.03，P＞0.05）。見圖3。

圖2 流式細胞術檢測阿司匹林對GBC-SD細胞凋亡的影響

2.4 阿司匹林對GBC-SD細胞中MCL-1、VEGF、STAT3和pSTAT3 蛋白表達的影響

Western blotting結果發現，阿司匹林可下調MCL-1、VEGF、pSTAT3蛋白的表達，電泳條帶與對照組相比灰度均逐漸降低（MCL-1：空白對照：1.03，1 mmol/L：0.69，3 mmol/L：0.47，5 mmol/L：0.08，F=5935，P＜0.05；VEGF：空白對照：1.57，1 mmol/L：1.22，3 mmol/L：0.61，5 mmol/L：0.18，F=6143，P＜0.05；pSTAT3：空白對照：1.32，1 mmol/L：1.39，3 mmol/L：0.71，5 mmol/L：0.31，F=6688，P＜0.05）。阿司匹林對STAT3蛋白表達的電泳條帶與對照組相比灰度差異不明顯（STAT3：空白對照：1.43，1 mmol/L：1.50，3 mmol/L：1.40，5 mmol/L：1.46，F=3.13，P＞0.05）。見圖4A。

2.5 STAT3激動劑處理后GBC-SD細胞中MCL-1、VEGF、STAT3和pSTAT3蛋白表達情況

實驗條件為阿司匹林5 mmol/L，設置空白對照組、阿司匹林處理組、空白+激動劑組、阿司匹林+激動劑組。結果發現，與空白組相比，加入激動劑后MCL-1、VEGF、STAT3和pSTAT3電泳條帶灰度均增加（圖4B，組1vs組3，MCL-1：1.32vs1.50，t=-6.12，P＜0.05；VEGF：1.09vs2.08，t=-18.3，P＜0.05；STAT3：0.69vs1.77，t=-37.7，P＜0.05；pSTAT3：1.51vs2.13，t=-9.41，P＜0.05）。加入阿司匹林后，除STAT3（組1vs組2，0.70vs1.48，t=-57.1，P＜0.05；組3vs組4，1.77vs2.27，t=3.3，P＜0.05）異常外，MCL-1、VEGF和pSTAT3電泳條帶灰度均降低（圖4B，組1vs組2，MCL-1：1.32vs0.14，t=351.2，P＜0.05；VEGF：1.09vs0.24，t=55.8，P＜0.05；pSTAT3：1.51vs2.13，t=-9.41，P＜0.05；組3vs組4，MCL-1：1.51vs0.37，t=34.3，P＜0.05；VEGF：2.07vs0.77，t=24.4，P＜0.05；pSTAT3：2.13vs0.78，t=-22.0，P＜0.05）。在激動劑作用后，除STAT3變化與阿司匹林加入情況不一致外（但與激動劑加入情況一致），雖然加入阿司匹林可使MCL-1、VEGF和pSTAT3電泳條帶相對灰度降低（圖4B，組3vs組4，同前），但與無激動劑組相比，條帶相對灰度較高（圖4B，組2vs組4，MCL-1：0.14vs0.37，t=-16.9，P＜0.05；VEGF：0.24vs0.77，t=-40.5，P＜0.05；pSTAT3：0.33vs0.78，t=-28.3，P＜0.05）。以上結果提示，阿司匹林不是通過影響STAT3 的表達，而是通過抑制STAT3 磷酸化從而下調MCL-1、VEGF的表達。

圖3 阿司匹林對GBC-SD細胞中MCL-1、VEGF和STAT3 mRNA表達的影響

圖4 不同濃度阿司匹林（A）及激動劑（B）對GBC-SD細胞中STAT3、pSTAT3、MCL-1和VEGF蛋白表達的影響

3 討論

研究表明慢性炎癥產生的炎癥介質會引起原癌基因活化和抑癌基因失活，進而啟動腫瘤進程，參與腫瘤的誘導、生長、血管生成及轉移[8]，同時慢性炎癥也會導致核因子kappa B（NF-κB）、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）等腫瘤相關的轉錄因子在腫瘤細胞中被激活，從而級聯激活下游的效應分子，在腫瘤微環境中形成復雜的反應網絡[9-10]。Grusz等[9]認為，阿司匹林作為非甾體類抗炎藥，可能通過抑制這些與炎癥和腫瘤相關的轉錄因子及其相關的信號通路發揮抑癌作用。已有研究證實，在胰腺癌中阿司匹林可以同時促進細胞凋亡和抑制細胞增殖[11]。在前列腺癌中，也可以通過抑制JAK-STAT3信號通路促進細胞凋亡而抑制腫瘤增殖[12]；另外在前列腺癌中，阿司匹林可以通過抑制STAT3磷酸化促進前列腺癌細胞凋亡和抑制增殖[13]。雖然流行病學發現阿司匹林可降低膽囊癌發病風險[7]，但是在機制研究方面目前國內外相關報道很少。本研究初步表明，阿司匹林可以抑制JAK/STAT3 信號通路中關鍵分子STAT3 的磷酸化，進而下調抗凋亡標記分子MCL-1和細胞增殖標記分子VEGF的表達水平，促進膽囊癌細胞凋亡，抑制增殖。

MCL-1基因是抗凋亡基因Bcl-2最主要的成員，具有Bcl-2家族基因的所有共同特征，在細胞抗凋亡中發揮廣泛作用，是抗凋亡家族的標記分子和治療靶點[14]。膽囊癌中MCL-1的表達高于正常上皮組織，與腫瘤細胞凋亡抑制相關[15]。結直腸癌[16]、乳腺癌[17]等腫瘤中也存在MCL-1基因及相應蛋白產物的高表達，與患者的不良預后、轉移等呈正相關。既往研究表明，MCL-1是STAT3信號通路的下游效應分子，被STAT3激活后發揮抗凋亡作用，促進口腔鱗狀細胞癌化療耐藥[18]。本研究結果提示，在膽囊癌細胞中，STAT3激動劑可上調MCL-1蛋白表達水平，阿司匹林作為抑制劑可下調MCL-1 的蛋白表達水平，證實在膽囊癌中MCL-1為STAT3信號通路的下游分子。由于阿司匹林可以通過抑制STAT3磷酸化下調MCL-1的表達，說明阿司匹林對膽囊癌細胞的抑制作用一部分是通過促進腫瘤細胞凋亡實現的。

VEGF由腫瘤細胞或基質產生，最主要的功能是促進血管生成[19]，因VEGF通路激活是腫瘤增殖的基礎，VEGF通常作為標記腫瘤增殖的常用參照基因[20-21]。已有研究證明VEGF在膽囊癌組織中有過度表達，并且與不良預后及轉移相關[22-23]。既往的研究多數認為阿司匹林對于VEGF的影響主要是通過抑制COX-2過表達實現的[24]。然而其他研究發現阿司匹林可通過抑制JAK/STAT3通路[25]抑制結腸癌的生長，而該通路被相應的抑制劑抑制后，可導致VEGF的下調[26]，但是阿司匹林是否直接通過抑制STAT3通路從而下調VEGF目前尚缺乏相關報道。本研究結果提示，STAT3 激動劑可上調VEGF蛋白表達水平，證實VEGF為STAT3 信號通路的下游分子，同時阿司匹林可以通過抑制STAT3磷酸化下調VEGF的表達，說明阿司匹林對膽囊癌細胞的抑制作用一部分是通過下調VEGF表達從而抑制細胞增殖實現的。

綜上所述，MCL-1和VEGF都是炎癥相關JAK/STAT3 信號通路的下游分子，而阿司匹林可以通過抑制STAT3磷酸化從而抑制STAT3信號通路的信號傳遞，進而下調MCL-1 和VEGF表達，促進膽囊癌細胞凋亡，抑制細胞增殖。

另外需要提及的是，雖然本研究探討了阿司匹林對膽囊癌細胞的凋亡及增殖影響的可能機制，為膽囊癌的化學治療提供了新的治療依據，但仍有以下不足：（1）本研究僅使用了GBC-SD膽囊癌細胞系，未檢測阿司匹林在其他膽囊癌細胞系中的作用；（2）僅限于體外研究，未在動物模型中進行體內驗證；（3）由于已有較多研究提示阿司匹林通過阻斷細胞周期的G0/G1期向S期的進程促進細胞凋亡[27-28]，本研究未對阿司匹林對膽囊癌細胞周期的阻斷時期做重復性研究；（4）在圖4B中，STAT3變化趨勢與是否加入阿司匹林相反，結合圖4A中的結果及文獻[27]，考慮可能為實驗誤差。雖然存在以上不足，但本研究在阿司匹林對膽囊癌細胞的作用機制上做出了有意義的嘗試，可以為后續研究提供參考。