Caspase-1抑制劑在大鼠脊髓損傷后的靶點(diǎn)作用

鎖志剛，丁惠強(qiáng)，費(fèi) 樂(lè)，黑 龍，戈朝暉，馬宗軍，陳霄雷

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院脊柱骨科，銀川 750004）

脊髓損傷可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷是可逆的，在脊髓損傷的治療中占主導(dǎo)作用。研究證實(shí)[1]，Caspase-1抑制劑是Caspase-1不可逆和可滲透細(xì)胞的特異抑制劑。本研究采用改良的Allen's重物打擊法建立大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）模型，通過(guò)HE染色、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)觀察Caspase-1抑制劑在SCI后對(duì)大鼠Caspase-1、白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18表達(dá)的抑制作用，以期為繼發(fā)性脊髓損害后靶點(diǎn)抑制作用提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

成年雄性SD大鼠72只（由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量250～300 g，隨機(jī)分為對(duì)照組、SCI組、AC.YVAD.CMK組、甲基強(qiáng)的松龍（methyl prednisolone，MP）組，每組18只，SCI組、AC.YVAD.CMK組及MP組大鼠均應(yīng)用改良的Allen's重物打擊法建立大鼠脊髓損傷模型，正常對(duì)照組大鼠只做全椎板切除。4組大鼠依據(jù)損傷后取材時(shí)間（分別于術(shù)后24 h、72 h、7 d處死）再各分3個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1.2 主要試劑

Caspase-1抑制劑：AC.YVAD.CMK購(gòu)自MC公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購(gòu)自Tiangen公司；甲基強(qiáng)的松龍購(gòu)自PfizerMamu facturingBelgiumNV公司；兔抗大鼠Caspase-1多克隆抗體、兔抗大鼠IL-l8多克隆抗體、IL-1β多克隆抗體、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 大鼠脊髓損傷模型制作及各組給藥

大鼠實(shí)驗(yàn)前常規(guī)禁食8 h，實(shí)驗(yàn)順序隨機(jī)。選用30 g·L-1的戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)背部剃毛、消毒鋪巾。無(wú)菌條件下取腰背部正中切口，逐層分開(kāi)顯露T8～T10椎板，行T9全椎板切除，顯露硬脊膜并使之保持完整，鉗夾固定T8及T10棘突，用直徑2.5 mm、質(zhì)量10.0 g的不銹鋼棒沿帶有刻度的玻璃導(dǎo)管從25 mm高處垂直下落，打擊在由塑料材料制成的底部呈凹面、直徑為3 mm的撞桿上，造成大鼠脊髓不完全損傷致傷后迅速移開(kāi)打擊物，0號(hào)線逐層縫合切口。

模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)：打擊后，損傷處脊髓出血、水腫，大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮樣撲動(dòng)，麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。造模成功后，AC.YVAD.CMK組大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)開(kāi)始給藥，藥物為AC.YVAD.CMK，濃度為0.3 mg/100 g，早晚各1次，連續(xù)3 d，MP組大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)開(kāi)始給藥，藥物為甲基強(qiáng)的松龍，濃度為30 mg·kg-1，早晚各1次，連續(xù)3 d，SCI組及對(duì)照組大鼠依據(jù)術(shù)中出血量的多少即刻腹腔內(nèi)注射等量的5%葡萄糖鹽水，以補(bǔ)充血容量。所有大鼠均給予青霉素鈉鹽500000 IU背外側(cè)肌群肌注預(yù)防感染，每天1次，持續(xù)3 d。大鼠注意保溫，分籠飼養(yǎng)，自由取食。每天早8：00及晚8：00行膀胱按摩協(xié)助排尿，直至建立反射性排空。

1.4 取材、切片制備

分別于術(shù)后24 h、72 h、7 d取各組大鼠6只，將大鼠過(guò)量麻醉，經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管，快速灌注冰生理鹽水（4℃）沖洗，待流出的液體清亮后，灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定45 min，自背部原切口顯露脊髓，以損傷處為中心，切取長(zhǎng)約2.0 cm脊髓組織，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液12～24 h，然后手工脫水，石蠟包埋（冠狀面切成長(zhǎng)約3 mm的多個(gè)節(jié)段包埋于同一蠟塊中），行冠狀面連續(xù)切片，每個(gè)組織塊連續(xù)切片8張，片厚4μm。

1.5 HE染色及Caspase-1、IL-1β及IL-18免疫組化染色

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每只大鼠隨機(jī)選取2張切片進(jìn)行HE染色，以損傷嚴(yán)重段脊髓取視野，光鏡下觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每只大鼠隨機(jī)選取2張切片分別進(jìn)行Caspase-1、IL-1β及IL-18免疫組化染色。免疫組化染色按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，一抗Caspase-1的工作濃度為1∶300，一抗IL-1β的工作濃度為1∶200，一抗IL-18的工作濃度為1∶500，最后用DAB顯色，鏡下觀察顯色背景，蒸餾水清洗終止顯色，蘇木素輕度復(fù)染，梯度脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性細(xì)胞，每例切片雙盲法計(jì)數(shù)，在400倍鏡下，隨機(jī)觀察計(jì)數(shù)6個(gè)視野，記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性表達(dá)率=6個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)/6個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，三組大鼠脊髓組織中Caspase-1、IL-1β及IL-18陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用行×列表的卡方檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓損傷組織形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組HE染色大鼠神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)規(guī)則，白質(zhì)致密。AC.YVAD.CMK組大鼠24 h時(shí)鏡下主要表現(xiàn)為損傷局部可見(jiàn)出血灶，神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，但大多數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)少量神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形死亡，周?chē)梢?jiàn)少量炎性細(xì)胞，以中性粒細(xì)胞為主；72 h時(shí)主要表現(xiàn)為出血灶大部分吸收，損傷周?chē)梢?jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞為主，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形壞死較24 h明顯，灰質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞空泡變性壞死，出現(xiàn)大量神經(jīng)元細(xì)胞死亡。存活的神經(jīng)元細(xì)胞中部分可見(jiàn)細(xì)胞膜破裂及核固縮；7 d時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較前明顯減少，可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞也較前明顯減少，并出現(xiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 大鼠脊髓組織中Caspase-1表達(dá)情況

Caspase-1陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞胞漿，染色后為棕黃色顆粒。對(duì)照組有少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，AC.YVAD.CMK組24 h時(shí)Caspase-1陽(yáng)性表達(dá)較SCI組少（圖1A），72 h時(shí)Caspase-1陽(yáng)性細(xì)胞減少，損傷周?chē)梢?jiàn)大量炎性細(xì)胞（圖1B），7 d時(shí)有少量Caspase-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（圖1C）。

在脊髓損傷后24 h、72 h和7 d時(shí)，SCI組Caspase-1陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組，AC.YVAD.CMK組Caspase-1陽(yáng)性表達(dá)率均低于SCI組（P均＜0.01）。24 h和72 h時(shí)，AC.YVAD.CMK組Caspase-1陽(yáng)性表達(dá)率低于MP組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠脊髓組織中Caspase-1陽(yáng)性表達(dá)率比較（%）

圖1 各組大鼠脊髓組織中Caspase-1、IL-1β和IL-18的陽(yáng)性表達(dá)情況（免疫組化×400）

2.3 大鼠脊髓組織中IL-1β的表達(dá)情況

IL-1β陽(yáng)性表達(dá)定位于胞漿，染色后為棕黃色顆粒。對(duì)照組大鼠脊髓組織中有少量細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性；MP組24 h時(shí)，鏡下可見(jiàn)IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞少于AC.YVAD.CMK組（圖1D）；72 h、7 d時(shí)，IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（圖1E、圖1F）。

在脊髓損傷后24 h、72 h和7 d時(shí)，SCI組IL-1β陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組，AC.YVAD.CMK組和MP組IL-1β陽(yáng)性表達(dá)率均低于SCI組（P均＜0.01）；24 h和72 h時(shí)，MP組IL-1β陽(yáng)性表達(dá)率均低于AC.YVAD.CMK組（P均＜0.01），見(jiàn)表2。

2.4 大鼠脊髓組織中IL-18的表達(dá)情況

IL-18陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞胞漿，染色后呈棕黃色顆粒。對(duì)照組大鼠脊髓組織中有少量細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性；SCI組24 h時(shí)鏡下IL-18陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組多（圖1H）；72 h時(shí)IL-18陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)達(dá)到峰值，損傷周?chē)梢?jiàn)大量炎性細(xì)胞（圖1I）；7 d時(shí)SCI組IL-18陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少仍較對(duì)照組多（圖1J）。

在脊髓損傷后24 h、72 h和7 d時(shí)，SCI組IL-18陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組，AC.YVAD.CM組和MP組IL-18陽(yáng)性表達(dá)率均低于SCI組（均＜0.01），24 h和72 h時(shí)，AC.YVAD.CMK組IL 18陽(yáng)性表達(dá)率低于MP組（P均＜0.05），見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠脊髓組織中IL-1β陽(yáng)性表達(dá)率比較（%）

3 討論

脊髓損傷是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，其病理機(jī)制仍不完全明確。研究表明[2]，損傷后炎性反應(yīng)在脊髓損傷中起重要的作用，可導(dǎo)致細(xì)胞的壞死及凋亡，從而加重神經(jīng)功能。Caspase-1又稱(chēng)IL 1β轉(zhuǎn)化酶（interleukin-1betacoveratingenzymeICE）[3]，是Caspase超家族的重要成員，被認(rèn)為主要參與機(jī)體的炎性反應(yīng)，在組織損傷過(guò)程中催化生成有活性的細(xì)胞因子IL-1β和IL-18，有促炎性反應(yīng)及級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。已有研究[4]證實(shí)Caspase-1、IL-1β及IL-18在脊髓損傷后表達(dá)增高，參與脊髓損傷后炎性反應(yīng)。

表3 各組大鼠脊髓組織中IL-18陽(yáng)性表達(dá)率比較（%）

研究證實(shí)[5-6]，MP在脊髓損傷治療中發(fā)揮重要的作用，其主要作用包括抑制炎性反應(yīng)，能夠抑制炎癥和炎性物質(zhì)釋放，對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)有促進(jìn)作用，是目前臨床上治療脊髓損傷的首選藥物。研究發(fā)現(xiàn)[7]，脊髓損傷早期使用高劑量MP沖擊療法治療脊髓損傷是有效的。黃星球等[8]研究表明，大劑量MP沖擊治療可明顯改善微環(huán)境，通過(guò)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)尼氏體染色，證實(shí)MP可改善脊髓損傷后神經(jīng)元形態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)元恢復(fù)。本研究結(jié)果表明，大劑量MP組炎性細(xì)胞相對(duì)減少，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)與SCI組、AC.YVAD.CMK組無(wú)明顯差別。對(duì)于大劑量MP在脊髓損傷后抑制炎性反應(yīng)的分子機(jī)制尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)在脊髓損傷后給予大劑量MP治療，可抑制損傷后Caspase-1、IL-1β及IL-18的表達(dá)，特別是IL-1β的陽(yáng)性表達(dá)。臨床上大劑量使用MP的并發(fā)癥有加重感染、誘發(fā)消化道出血及穿孔、導(dǎo)致股骨頭壞死等。如何減少相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，是否能減少M(fèi)P的使用量或者使用時(shí)間以及有無(wú)替代治療方法，是目前臨床關(guān)注的主要問(wèn)題。

Caspase-1抑制劑可直接抑制Caspase-1的活性，阻礙其介導(dǎo)炎性反應(yīng)的分子信號(hào)通路。關(guān)于Caspase-1抑制劑的研究多集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦損傷方面[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，Caspase-1抑制劑在腦損傷及腦膿腫動(dòng)物模型中有顯著療效，能減輕腦水腫，對(duì)腦缺血后神經(jīng)元具有保護(hù)及促進(jìn)修復(fù)作用，還能促進(jìn)炎性反應(yīng)的進(jìn)展。本研究表明，AC.YVAD.CMK組在HE染色光鏡下可見(jiàn)，損傷脊髓組織中炎性細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)相對(duì)減少，提示Caspase-1抑制劑可以減輕脊髓損傷后炎性反應(yīng)，減輕組織水腫。應(yīng)用AC.YVAD.CMK后可減輕缺血組織的損傷程度，抑制神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能，減輕腦水腫，推測(cè)AC.YVAD.CMK是通過(guò)抑制IL-1β而減輕腦水腫[12]。本研究表明，在應(yīng)用AC.YVAD.CMK后，Caspase-1的陽(yáng)性表達(dá)較MP組及SCI組降低，提示Caspase-1抑制劑在脊髓損傷后對(duì)Caspase-1有特異性抑制作用。AC.YVAD.CMK組及MP組IL-1β及IL-18的陽(yáng)性表達(dá)均低于SCI組，提示Caspase-1抑制劑可以有效抑制細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的表達(dá)，也進(jìn)一步證實(shí)IL-1β和IL-18是Caspase-1特異有效的蛋白酶。在組織損傷過(guò)程中，通過(guò)催化生成有活性的細(xì)胞因子IL-1β和IL-18，是導(dǎo)致炎癥進(jìn)一步發(fā)揮致炎促損傷的原因。損傷后7 d，AC.YVAD.CMK及MP組的Caspase-1、IL-1和IL-18與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Caspase-1抑制劑阻斷了炎性反應(yīng)的進(jìn)程，減輕了脊髓損傷組織水腫，為促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)提供了微環(huán)境。

綜上，Caspase-1抑制劑及MP均可以減輕損傷后脊髓組織中炎性細(xì)胞的表達(dá)，降低脊髓損傷后Caspase-1、IL-1β及IL-18的陽(yáng)性表達(dá)。Caspase-1抑制劑可能對(duì)SCI后的繼發(fā)性損傷有一定的靶向抑制作用，可促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)。