基于網絡藥理學探究“黃芪-當歸”治療慢性再生障礙性貧血的作用機制*

楊志文，何 靖，劉增慧，麥喆钘

(1. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院血液科，廣州 510405； 2. 廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州 510405)

再生障礙性貧血(AA)是一種由多病因引起的造血衰竭綜合征，主要以貧血、感染和出血為臨床表現，其發病率在我國為0.74/10萬[1]。AA主要分為重型再生障礙性貧血(SAA)和慢性再生障礙性貧血(CAA)[1]，其中SAA病情危重，若無及時積極的治療，多導致患者死亡[2]，而CAA治療療程長，給患者及社會帶來沉重的經濟負擔[3]。目前針對AA的治療手段主要有造血干細胞移植(HSCT)和免疫抑制治療(IST)，但是HSCT受到多條件限制，并非所有患者均適用[1]，而IST雖適用于大部分患者，但是長期接受IST會增加嚴重感染的風險[2]。而在近年的研究中發現，中醫藥在治療CAA上具有獨到之處，可增強治療效果，改善患者生存質量[4-5]。

CAA在中醫古籍中并無此病名，但根據其臨床表現，屬于中醫學“虛勞”范疇，病機主要是氣陰虧虛，治療原則為健脾益氣、滋陰養血[6]。根據本研究團隊對于臨床的觀察并結合中醫大家的經驗，發現黃芪-當歸藥對在治療CAA中運用最多[7]。然而，現在仍缺少對于黃芪-當歸藥對治療CAA的機制研究，同時由于中藥成分復雜，在體內作用靶點眾多，作用機制十分復雜，單憑動物或細胞實驗進行機制研究是較難實現的。因此，本研究團隊基于網絡藥理學原理，對黃芪-當歸的有效成分、作用靶標及相關信號通路進行分析，通過網絡分析的方法揭示其治療CAA的作用機制。

1 資料與方法

1.1 獲取黃芪-當歸的活性成分

分別以“黃芪”和“當歸”為關鍵詞，在中藥系統藥理學分析平臺(http：//lsp.nwu.edu.cn/，TCMSP)檢索黃芪和當歸的所有化學成分。根據毒藥物動力學原理指導，設定“OB(口服度)≥30%”和“DL(類藥性)≥0.18”為篩選條件[8]，篩選出可作為藥物被人體吸收的化學成分，作為黃芪-當歸的活性成分。

1.2 獲取成分-疾病靶標

1.2.1 獲取活性成分靶標 從TCMSP數據庫獲取活性成分(1.1項)Pubchem CID錄入Pubchem數據庫，獲取該活性成分的化學結構式和平面結構圖。將各化學結構式輸入SwissTargetPrediction服務器，基于反向分子對接法，獲得各成分的可作用靶標，并根據probability(結合概率)值由大到小排名，選取前15位的可作用靶標作為活性成分靶標[9]，并獲取活性成分靶標對應的Uniprot ID。

1.2.2 獲取疾病靶標 以“chronic aplastic anemia”或“CAA”為關鍵詞在Genecards數據庫上檢索CAA的相關靶標，取2次檢索結果的合集結果作為疾病靶標。

1.2.3 獲取成分-疾病靶標 篩選出活性成分靶標與疾病靶標的交集部分，作為黃芪-當歸治療CAA中可發揮作用的靶標，即成分-疾病靶標。

1.3 獲取有效成分-成分-疾病靶標網絡

篩選出活性成分(1.1項)中可作用于成分-疾病靶標的成分(1.2.3項)，作為有效成分。將有效成分和成分-疾病靶標及兩者間的對應關系(1.2.1項)導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建有效成分-成分-疾病靶標網絡，通過讀圖進行分析與研究。

1.4 獲取核心靶標

1.4.1 獲取潛在核心靶標 將成分-疾病靶標(1.2.3項)的Uniprot ID(1.2.1項)導入String數據庫，限定物種條件為“Homo sapiens”，并將結果導入Cytoscape 3.6.0軟件繪制成分-疾病靶標的相互作用網絡(Protein-protein interactions,PPI)，利用該軟件的網絡分析工具通過Degree值算法，篩選出黃芪-當歸治療CAA時發揮作用最大的5個潛在核心靶標。根據Degree值大小調整節點的面積，繪制PPI網絡圖，其中Degree值越大則節點面積越大，并通過讀圖進行分析與研究。

1.4.2 分子對接驗證潛在核心靶標與有效成分的結合力 通過System Dock Web Site 服務器(http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index)，對潛在核心靶標的真實性進行驗證。從Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)獲取成分-疾病靶標的PDB ID，再將成分-疾病靶標的PDB ID與有效成分的平面結構式(1.2.1項)輸入到System Dock Web Site服務器進行分子對接，得到對接評分。根據對接評分大小評價兩者之間的結合潛力，分析核心靶標的真實性。當對接評分>7.0時，表示其結合能力很高；當對接評分>5.0時，表示其結合能力較高；當對接評分>4.25時，表示分子和靶標具有一定的結合能力[10]。

1.5 GO分析和KEGG分析

將成分-疾病靶標(1.2.3項)導入DAVID數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/)，限定標識符為“UNIPROT ACCESSION”，列表類型條件為“Gene List”，得出KEGG通路富集分析和GO分類富集分析的結果。GO分類富集分析包括生物過程、細胞組分和分子功能三部分。選取滿足KDR值少于0.05的信號通路，作為黃芪-當歸治療CAA的相關通路，結合相關文獻進行分析。

1.6 繪制有效成分-成分-疾病靶標-重要通路網絡圖

通過閱讀文獻，篩選出目前研究認為與CAA發病及治療相關的通路，作為重要通路。取富集于重要信號通路上的靶標與成分-疾病靶標(1.2.3項)的交集部分；將交集靶標與有效成分(1.3項)相配對，將三者的配對關系導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建有效成分-成分-疾病靶標-重要通路的網絡，通過讀圖進行分析與研究黃芪-當歸治療CAA的特點。

2 結果

2.1 黃芪-當歸活性成分的篩選

表1示，檢索到黃芪-當歸的化學成分有212個，符合納入條件的活性成分共20個，包括豆甾醇、谷固醇、槲皮黃酮、葉酸等。

表1 黃芪-當歸活性成分比較

2.2 成分-疾病靶標的篩選

表2示，黃芪-當歸的20個活性成分在SwissTargetPrediction服務器中共獲得靶標300個；在Genecards數據庫中獲取CAA相關靶標5557個，與300個成分靶標取交集后獲得成分-疾病靶標144個。

表2 成分-疾病靶標

2.3 有效成分-成分-疾病靶標網絡

表1示，篩選出有效成分共20個，即活性成分均為有效成分。圖1示，有效成分-成分-疾病靶標網絡圖，其中有164個節點，包括20個有效成分(矩形節點)和144個成分-疾病靶標(圓形節點)；有邊線266條，代表20個有效成分與144個靶標之間具有266種作用關系，表示同一靶標可對應不同的有效成分，不同的有效成分也可作用于不同的靶標，由此看出，黃芪-當歸治療CAA具有多成分、多靶標的特點。

圖1 有效成分-成分-疾病網絡

2.4 核心靶標

圖2示，PPI網絡圖包括節點141個，邊線1023條。圖中圓形節點表示作用靶標，邊表示靶標之間的相互作用關系。由于CA1、PDE8B、RORA 3個靶標與其他靶標之間未有相互作用關系，所以未在圖中表示。表3示，其中連接度最高的5個分別是VEGF、EGFR、IFN、TNF、AR。分子對接驗證結果為18種對接關系的對接評分>7.0，占比18%；有42種對接關系的對接評分在 7.0～5.0之間，占比42%；有33種對接關系的對接評分在5.0～4.25之間，占比33%；有7種對接關系的對接評分<4.25，占比7%。因此，上述5個靶標確為核心靶標。PPI網絡圖也證明，黃芪-當歸治療CAA不僅是通過廣泛作用多個靶標而發揮療效，還可通過靶標之間的相互影響產生復雜的網絡調節效果。

圖2 PPI網絡圖

表3 核心靶標信息比較

2.5 GO分析結果

表4示，GO分類富集分析結果中符合篩選條件的生物過程有20個；表5示，細胞組分有10個；表6示，分子功能有15個。

表4 生物過程分析結果比較

表5 細胞組分分析結果比較

表6 分子功能分析結果比較

2.6 KEGG結果與分析

表7示，KEGG通路富集分析結果中符合篩選條件的信號通路有20條。閱讀相關文獻后，本團隊認為黃芪-當歸治療冠心病主要通過調控PI3K-Akt信號通路和VEGF信號通路發揮療效。

表7 KEGG通路富集分析結果

2.7 有效成分-成分-疾病-重要通路網絡構建

圖3示，圖中有節點41個，代表2個藥物(三角形)，12個有效成分(六邊形)，25個成分-疾病靶標(圓形)，2條重要通路(矩形)。黃芪-當歸治療CAA的作用機制主要是由12個有效成分作用于25個成分-疾病靶標，進而調控PI3K-Akt通路和VEGF通路。

圖3 有效成分-成分-疾病-重要通路網絡

3 討論

再生障礙性貧血屬于中醫學“虛勞”范疇。本團隊發現，臨床上多用黃芪-當歸藥對治療。據報道，黃芪具有調節機體免疫、增加骨髓造血的作用；當歸可以減少細胞凋亡，改善造血微環境，從而發揮促進造血的作用[11]。

圖1示，黃芪-當歸治療CAA的有效成分為括葉酸、槲皮黃酮、谷固醇、豆甾醇等。研究發現，AA患兒體內的葉酸水平較正常兒童低，對AA患兒常規治療后，葉酸水平有所升高，但仍低于正常水平[12]。因此本團隊考慮，黃芪-當歸可通過直接補充葉酸來治療CAA。本團隊發現，對于大部分的有效成分，國內外尚缺少治療CAA的藥理學研究，這提示研究者可從中藥單體切入進行更進一步的研究。除此以外，從圖1中還可以直觀的發現，黃芪-當歸治療CAA具有多成分、多靶標的特點。

從PPI網絡圖可得，各成分-疾病靶標之間存在復雜的相互作用關系，表明黃芪-當歸的治療機制復雜多樣，不僅是有效成分作用于某一靶標發揮作用，同時成分-疾病靶標之間的相互作用也可有影響。研究得出VEGF、IFN、TNF、AR、EGFR為核心靶標，分子對接結果也驗證了核心靶標的真實性。本團隊認為，核心靶標在治療過程中可發揮較為重要的作用，該推論也與既往研究相符。研究發現，VEGF是體外誘導骨髓間充質干細胞向內皮細胞分化的重要因子之一。VEGF的高表達可促進骨髓微血管的形成，為造血細胞的成熟與分化提供有利環境，促進AA患者造血功能的恢復[13-14]。因此本團隊推測，黃芪-當歸可能是通過促進VEGF的高表達來發揮療效。IFN是一種負性造血調控因子，在AA患者中表達異常，導致機體體液免疫出現異常，抑制機體造血干/祖細胞增殖，從而導致AA的發生[15]。研究發現，中藥復方聯合常規用藥治療AA患者后，可明顯減低IFN的表達，抑制T細胞向Th1細胞分化，逆轉AA中的Th1優勢，進而改善免疫功能和造血微環境[16-17]。同時TNF也是一種負性造血調控因子，在AA的發病機制中具有與IFN類似的作用，可加快造血干/祖細胞凋亡[18-19]。其相關研究也證明，藥物治療后AA患者體內的IFN和TNF水平均會下降[20-21]，所以本團隊認為黃芪-當歸可通過降低IFN和TNF的表達活性來治療CAA。對于造血系統，AR主要分布在骨髓基質細胞、血小板和紅系祖細胞[22]，與雄激素結合后可刺激促紅細胞生成素的分泌，從而改善造血功能[23]。對此，本團隊推測黃芪-當歸可通過增加AR的表達，從而充分發揮雄激素的生物功能，或者發揮類雄激素效果直接作用于AR，促進促紅細胞素的生成。本研究發現，EGFR在治療CAA中為核心靶標之一，但目前在CAA方面尚未對該靶標具體的藥理學研究，提示研究者可以此為切入點，進行更深一步的探究。

圖3示，由KEGG通路富集分析結果和有效成分-成分-疾病靶標-信號通路網絡圖可看出，現有研究認為黃芪-當歸可通過調控PI3K-Akt信號通路和VEGF信號通路來治療CAA。PI3K-Akt通路下游還有眾多通路，其中PI3K-Akt-mTOR通路在調節造血干細胞增殖與分化中發揮著重要作用[24-25]。程明秀[26]等在骨髓間充質細胞(BMSCs)與骨髓單個核細胞(BMNCs)共培養體系中加入滋腎生血藥物后發現，藥物可促進BMSCs分泌SDF-1，結合造血干細胞的CXCR4受體，激活PI3K-Akt-mTOR通路促進血管的生成，加強造血作用。VEGF信號通路在調控血管生成上發揮著重要作用[27]。研究發現，當VEGF水平升高后可激活VEGF通路的下游Notch通路，促進血管的形成與發育，并改善BMSCs的分化能力[28]。本團隊分析，黃芪-當歸治療CAA主要是調控PI3K-Akt-mTOR通路的活性，同時調控VEGF通路，促進BMSCc向血管內皮細胞分化，增加新生血管，調節造血功能，改善血象與癥狀。

由GO分類富集分析結果可得，黃芪-當歸治療CAA除影響免疫功能和造血功能外，還會對體內多種分子功能、細胞組分、生物過程產生影響。這可能是中醫“整體觀”的具體表現。

綜上所述，本研究體現了黃芪-當歸治療CAA的過程中涉及多個有效成分、成分-疾病靶標及多條信號通路，證實其作用機制復雜的觀點。本研究大部分結論與現有研究結果相一致，但同時仍有部分結果未能有相關研究支持，這可能是多次對數據進行交互分析產生的誤差，但也不否認這是由于研究不全面所導致的，所以本研究為研究者提供了新的研究切入點。本研究僅從理論層面研究黃芪-當歸治療CAA的作用機制，尚未考慮中藥煎煮中發生的成分變化，所以仍需更多的臨床試驗與相關細胞、分子實驗對結論進行驗證。