基于AQP9和線粒體細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)性探討健脾活血祛濕方對(duì)體外培養(yǎng)H22肝癌細(xì)胞的影響*

李 嘉，高 玲，楊孝芳，張 軍，蒲 翔，施楊婉玲

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽(yáng) 550025)

肝癌是最常見的結(jié)締組織瘤之一，每年在全世界范圍有60萬(wàn)新增患者，其惡性程度僅次于胃癌和食道癌，在所有腫瘤相關(guān)性死因中排在第三位[1]。中藥對(duì)減輕肝癌患者的臨床癥狀，提高患者的生存質(zhì)量和免疫功能、預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移都具有重要作用[2]。課題組以“毒損肝絡(luò)”理論為用藥的指導(dǎo)依據(jù)，自擬健脾活血祛濕方輔助治療肝癌。前期研究結(jié)果顯示，本方可顯著提高肝硬化腹水大鼠線粒體水通道蛋白8、9(aquaporin8、9，AQP8、9)的表達(dá)，減輕線粒體水腫，同時(shí)促進(jìn)線粒體ATP合成，改善肝功能，提高細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase，COX)活性表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞在線粒體途徑的凋亡[3]。為進(jìn)一步研究本方在治療肝癌中可能存在的作用及作用機(jī)制，課題組進(jìn)行體外培養(yǎng)H22肝癌細(xì)胞，在不同劑量健脾活血祛濕方的給藥干預(yù)下，觀察細(xì)胞的增殖抑制率、凋亡率及線粒體膜電位和AQP9的改變，為中醫(yī)藥治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

H22小鼠肝癌細(xì)胞，購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞保存中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

健脾活血祛濕方組成：五爪龍30 g，白術(shù)30 g，白背葉根30 g，豬苓15 g，田基黃20 g，茜草15 g，土鱉蟲10 g，砂仁5 g(后下)，全部藥材均購(gòu)自貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥房，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版要求。先加蒸餾水浸泡40 min，一煎加藥材量的8倍水，沸騰后煎40 min；二煎加藥材量的6倍水，沸騰后煎30 min過(guò)濾，2次所得濾液混合后干燥濃縮至15 ml，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ? g/m1的原液，80 ℃水浴30 min，連續(xù)3 d滅活后，1000rpm離心10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)時(shí)以含2%DMEM培養(yǎng)液倍比稀釋。

1.3 主要試劑

胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)；DMSO(美國(guó)Sigma公司)；胰蛋白酶、PBS緩沖液、Trizol(均為Invitrogen公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit withgDNAEraser，RR047 A、TBGreen? Premix Ex TaqTMII，RR820 A(均為TAKARA公司)；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇(均購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠)；DEPC(上海生工(GAPDH抗體)(1∶4000稀釋液)，杭州三箭公司；AQP9抗體(1∶400稀釋液)，博世德公司(批號(hào)BA3619-2)；Bax抗體(1∶1000稀釋液)，CST公司(批號(hào)5023)；Bcl-2抗體(1∶1000稀釋液)，CST公司(批號(hào)2870)；注射用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX):200 mg/瓶，德國(guó)Baxter Oncology Gmbh 公司。

1.4 儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡(美國(guó)thermo公司)；低速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)thermo公司)；ABI7500熒光定量PCR儀(美國(guó)Invitrogen公司)；PCR儀(美國(guó)thermo公司)；DYY7C型電泳儀電源(北京市六一儀器廠)；TY-80B脫色搖床(江蘇金壇市萊華儀器制造有限公司)；電泳槽(Tanon公司)；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(Tanon公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的小鼠H22細(xì)胞，置于含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)孵育，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并用臺(tái)盼蘭染色，計(jì)算細(xì)胞存活率達(dá)95%以上，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用PBS緩沖液清洗2遍，經(jīng)胰蛋白酶消化后，加入4 mL DMEM高糖培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的消化，充分均勻吹打，使H22細(xì)胞處于單個(gè)懸浮狀態(tài)，對(duì)H22細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.2 比色法(MTT)測(cè)定

H22細(xì)胞增殖抑制率將藥物做系列倍比稀釋成高濃度(200 mg/ml)、中濃度(100 mg/ml)、低濃度(50 mg/ml)，同時(shí)設(shè)置不加任何藥物的空白組和CTX組(20 mg/ml)，在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，標(biāo)記為A、B、C、D。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為3×103/mL，接種在2塊96孔板中。96孔板外圍孔加入PBS緩沖液0.1 ml/孔，中間60孔每孔加入100μLDMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。24 h后取孔板A每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清加入DMSO 150 μL，充分振蕩溶解結(jié)晶，在490 nm波長(zhǎng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的吸光度(A)，計(jì)算藥物作用24 h細(xì)胞增殖抑制率。同理測(cè)出48 h、72 h、96 h孔板B、C、D各孔吸光度。增殖抑制率=(對(duì)照組A490-實(shí)驗(yàn)組A490)/對(duì)照組A490×100%。

2.3 Annexin V-FICT/PI檢測(cè)

H22細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為6×104/mL接種在6孔板中，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后離心收集2×104個(gè)細(xì)胞，雙蒸水稀釋5×Binding Buffer為1×工作液，取500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。每個(gè)流式管加入5 μL Annexin V-FICT和10 μL PI，避光靜置5 min。通過(guò)FICT檢測(cè)通道(FLI)檢測(cè)Annexin V-FICT(Ex=488 nm；Em=530 nm)，通過(guò)PE檢測(cè)通道檢測(cè)PI(FL2)。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)

表1示，H22細(xì)胞AQP9的表達(dá)細(xì)胞加1 ml Trizol提取總RNA，室溫放置5 min，加入200 μL氯仿，顛倒混勻后室溫放置15 min，4℃ 12000 g離心15 min，吸取上層水相，至另一離心管中，加入0.5 ml異丙醇混勻，室溫放置5～10 min，4℃ 12000 g離心10 min，棄上清，RNA沉于管底，加入1 ml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，洗滌沉淀，4 ℃ 8000 g離心5 min，盡量棄上清，室溫晾干或真空干燥5～10 min，加入50 μL DEPC處理過(guò)的H2O溶解并測(cè)量RNA濃度。從-80 ℃冰箱中取出樣品RNA 4 ℃下解凍，然后在 0.2 ml PCR 管中配制反應(yīng)溶液。

表1 引物設(shè)計(jì)

反應(yīng)體系：DNA 模板2 μL，PCR Forward Primer(10 μM)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μM)0.4 μL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus) (2×)10 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，dH2O Up to 20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5sec4℃。將PCR管置于定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為:95 ℃，30 s；95 ℃，3s；60 ℃，30 s，40 Reps，Melt Curve Stage。使用2^-ΔΔCт計(jì)算相對(duì)mRNA含量，ΔCт=Cт(目的基因)—Cт(管家基因)GAPDH，ΔCт=ΔCт(各用藥組)—ΔCт(空白組)，2^-ΔΔCт表示各用藥組目的基因mRNA的含量相對(duì)空白組所改變的倍數(shù)。

2.5 免疫印跡法(Western Blotting,WB)檢測(cè)

H22細(xì)胞AQP9、B細(xì)胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X protein, Bax)的表達(dá)低溫提取蛋白，蛋白定量，加入含2-ME(巰基乙醇，強(qiáng)還原劑)的5×上樣緩沖液(1∶50)100 ℃變性5 min，12%的SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂奶粉于搖床上封閉1 h。一抗孵育：取出封閉好的PVDF膜，用TBST漂洗，根據(jù)目的蛋白分子量大小與內(nèi)參剪開，放入相應(yīng)稀釋好的一抗中孵育，4 ℃過(guò)夜。二抗孵育：第2天回收一抗，PVDF膜用TBST洗5遍，于搖床上進(jìn)行洗滌，每次5 min。洗滌結(jié)束后，開始孵育二抗，二抗稀釋比例為1∶6000，搖床上室溫孵育50 min。用TBST洗膜5次，每次5 min，預(yù)先配好顯影液、定影液、ECL發(fā)光液，每張膜上加200-300ulECL液進(jìn)行曝光。

2.6 共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察

JC-1法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位，取制備好的線粒體混懸液使用流式細(xì)胞儀按JC-1法檢測(cè)。取適量JC-1(200×)，按照每50 μL JC-1(200×)加入8 mL超純水比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1，然后再加入2 mL JC-1染色緩沖液(5×)，混勻后把試劑盒中提供的CCCP(10mM)推薦按照1∶1000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10 μM，處理細(xì)胞20 min，共振聚焦顯微鏡觀察。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 MTT法測(cè)定H22細(xì)胞增殖抑制率

圖1示，與空白組比較，CTX組在48 h、72 h和96 h對(duì)小鼠H22肝癌細(xì)胞的抑瘤率明顯升高(P<0.05)；與CTX組比較，健脾活血祛濕方各劑量組的抑瘤率呈時(shí)間/劑量依賴性增高(P<0.05)，其中高劑量組在96 h的抑瘤率達(dá)最高。

注：與空白組比較：*P<0.05；與CTX組比較：△P<0.05

3.2 Annexin V-FICT/PI檢測(cè)H22細(xì)胞凋亡率

圖2示，Q2-UL表達(dá)晚期凋亡群體，Q2-UR表達(dá)中晚期凋亡群體，Q2-LL表達(dá)未凋亡群體，Q2-LR表達(dá)早期凋亡群體，圖中箭頭所指部分區(qū)域面積表示整體凋亡率。圖2表2示，與空白組比較，CTX組的凋亡率明顯增加(P<0.05)；與CTX組比較，健脾活血祛濕方各劑量組凋亡率均明顯增加(P<0.05)，其中高劑量組表達(dá)顯著(P<0.05)。

圖2 Annexin V-FITC/PI檢測(cè)H22肝癌細(xì)胞凋亡

表2 Annexin V-FITC/PI檢測(cè)H22肝癌細(xì)胞凋亡比較

3.3 RT-PCR檢測(cè)H22細(xì)胞AQP9的表達(dá)

圖3示，與空白組比較，CTX組的AQP9mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯增高(P<0.05)；與CTX組比較，健脾活血祛濕方高劑量組的AQP9mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯增高(P<0.05)，中、低劑量組的AQP9mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯下降(P<0.05)，各劑量組呈劑量依賴性增高(P<0.05)。

注：與空白組比較：*P<0.05；與CTX組比較：△P<0.05

3.4 WB法檢測(cè)H22細(xì)胞AQP9、Bax、Bcl-2的表達(dá)

圖4、5示，與空白組比較，CTX組的AQP9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平均有顯著增高(P<0.05)；與CTX組比較，健脾活血祛濕方各組AQP9、Bax蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性增高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)呈劑量依賴性下降(P<0.05)。

注：A.空白組; B.CTX組;C.低劑量組; D.中劑量組;E.高劑量組

注：與空白組比較：*P<0.05；與CTX組比較：△P<0.05

3.5 共聚焦顯微鏡觀察

JC-1法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位：紅色熒光表示細(xì)胞線粒體膜電位較高，綠色熒光表示細(xì)胞線粒體膜電位較低。圖6示，空白組Merge無(wú)明顯綠色熒光細(xì)胞顯示，以紅色熒光為主要表達(dá)(箭頭所示)；與空白組比較，CTX組Merge顯示綠色熒光增多(箭頭所示)，提示線粒體膜電位有明顯降低；與CTX組比較，健脾活血祛濕方低、中劑量組Merge顯示綠色熒光變淺(箭頭所示)，高劑量組Merge主要表達(dá)綠色熒光且漸強(qiáng)(箭頭所示)，提示健脾活血祛濕方可顯著降低線粒體膜電位，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖6 共聚焦顯微鏡觀察JC-1檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位(DAB×200)

4 討論

肝癌屬于中醫(yī)學(xué)“肝積”“積聚”“癥瘕”等范疇，一般認(rèn)為由于情志不暢、飲食勞倦、寒邪侵襲以及久病不愈、耗氣傷血等因素影響臟腑氣機(jī)異常變化，絡(luò)脈郁滯不通、津血互換失常、痰濕血瘀凝滯脈絡(luò)而終成本病[4]。肝癌屬于本虛標(biāo)實(shí)之證。絡(luò)病學(xué)認(rèn)為“毒損肝絡(luò)”是肝癌形成的基本病理過(guò)程，其基礎(chǔ)理論認(rèn)為毒瘀作祟阻滯于肝絡(luò)出現(xiàn)絡(luò)虛、毒侵，而化毒為害則是絡(luò)病遷延和深化的關(guān)鍵所在，此時(shí)的疾病處于正虛邪實(shí)、病勢(shì)膠著狀態(tài)。課題組根據(jù)此理論以健脾活血祛濕方輔助治療肝癌。本方以五爪龍、白術(shù)為君，共奏健脾益氣、補(bǔ)益肝絡(luò)、化濕行水之功；以田基黃、豬苓、白背葉根三藥為臣，以達(dá)健脾通絡(luò)、清熱利水之效；土鱉蟲、茜根活血化瘀、通絡(luò)為佐，砂仁調(diào)理脾胃、辛溫化濕為使，達(dá)到利濕而不傷脾胃之效。全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，藥味精煉，共奏健脾、通絡(luò)、祛濕之功。現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，五爪龍具有良好的抗病毒、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用；白術(shù)具有良好的保肝利膽作用，常用于治療肝硬化腹水、消癥積；白背葉根具有良好的保肝利膽、抗纖維化作用；田基黃具有保肝護(hù)肝、抗病毒、增強(qiáng)免疫等作用；豬苓、茜根同樣具有良好的保肝護(hù)肝作用。課題組前期研究結(jié)果表明, 健脾活血祛濕方能緩解肝細(xì)胞線粒體損傷，改善肝線粒體代謝功能，并具有良好的保肝作用。課題組推測(cè)其機(jī)制可能是通過(guò)激發(fā)線粒體細(xì)胞凋亡途徑，促進(jìn)肝臟壞損細(xì)胞的早期凋亡。同時(shí)本研究結(jié)果也提示，健脾活血祛濕方各劑量組可呈時(shí)間/劑量依賴性地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

AQP是一種廣泛存在于細(xì)胞膜上的水通透性蛋白，是近年在腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前共發(fā)現(xiàn)有13個(gè)成員(命名為AQP0-12)，主要介導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡時(shí)水的內(nèi)外膜運(yùn)動(dòng)。肝細(xì)胞上有多種AQPs且每種表達(dá)數(shù)量各異，其中AQP9是最重要的一種[5]。一些水通道蛋白在腫瘤中異常表達(dá)，并參與腫瘤的凋亡、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[6]。研究證實(shí)，AQP9表達(dá)于正常肝臟，在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下降，使得肝癌細(xì)胞對(duì)滲透壓反應(yīng)和對(duì)凋亡的刺激性下降，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[7]；AQP9在肝臟腫瘤細(xì)胞中比正常肝細(xì)胞表達(dá)顯著減少，離體肝臟腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜的水通透性極低，對(duì)凋亡誘導(dǎo)信號(hào)反應(yīng)遲鈍，而正常肝細(xì)胞反應(yīng)迅速。本研究表明，健脾活血祛濕方各劑量組的AQP9表達(dá)均呈劑量依賴性升高，課題組推測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡可能是因?yàn)楦弑磉_(dá)的AQP9增加了肝癌細(xì)胞的通透性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外水代謝的運(yùn)轉(zhuǎn)，線粒體基質(zhì)的滲透壓升高，激活相關(guān)凋亡因子，引起半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)，最終導(dǎo)致細(xì)胞核皺縮，核染色凝縮和核碎裂等現(xiàn)象。同時(shí)Annexin V-FICT/PI結(jié)果也提示，健脾活血祛濕方可呈劑量依賴性地促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

線粒體釋放凋亡酶激活因子誘導(dǎo)Caspase家族產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致癌細(xì)胞的不可逆凋亡，這一過(guò)程在肝癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。線粒體細(xì)胞凋亡途徑是三大經(jīng)典凋亡途徑的中心途徑，以線粒體膜電位下降為標(biāo)志，引起相關(guān)凋亡蛋白Bax、Bcl-2與一些通道蛋白PTP、AQP等變位，形成調(diào)亡小體導(dǎo)致凋亡。具體途徑可表現(xiàn)為細(xì)胞受外界因素?fù)p傷刺激引起線粒體膜電位下降，ATP合成降低，胞質(zhì)Ca2+升高以及細(xì)胞內(nèi)活性氧種類(reactive oxygenspecies, ROS)的增加，使腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(adenine nucleotide tranporter, ANT)的構(gòu)象改變，進(jìn)而導(dǎo)致PT孔開放。繼而ATm及內(nèi)膜腺苷轉(zhuǎn)位酶(APH)崩解，呼吸鏈解偶聯(lián)，線粒體基質(zhì)的滲透壓升高、內(nèi)膜腫脹，膜內(nèi)外形成滲透梯度，水通道蛋白迅速有選擇性地將水排出，使細(xì)胞凋亡性容積減小(apoptotic volume decrease, AVD)[9-10]，導(dǎo)致細(xì)胞水分丟失。同時(shí)伴隨線粒體膜間隙的細(xì)胞色素c(cytochrome c, Cyt-C)、Smac/DIABLO、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis induced factor, AIF)、核酸內(nèi)切酶G(endonucleaseG, EndoG)、Bcl-2蛋白家族等的釋放，通過(guò)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，健脾活血祛濕方高劑量組細(xì)胞線粒體膜電位有下降并出現(xiàn)核皺縮，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡趨勢(shì)；同時(shí)Western Blot檢測(cè)結(jié)果也提示，健脾活血祛濕方促進(jìn)AQP9、Bax表達(dá)增高、Bcl-2表達(dá)降低，增加促凋亡Bax與抗凋亡Bcl-2比值；Annexin V-FICT/PI結(jié)果也提示，健脾活血祛濕方可呈劑量依賴性地增高肝癌細(xì)胞凋亡率。

隨著對(duì)AQP9的進(jìn)一步研究，尤其針對(duì)其在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的顯著差異表達(dá)，課題組自擬健脾活血祛濕方以研究該方基于AQP9促肝癌細(xì)胞凋亡的可能性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示，健脾活血祛濕方能夠通過(guò)線粒體依賴途徑觸發(fā)肝癌細(xì)胞凋亡，這可能與AQP9具有一定相關(guān)性，但是否直接調(diào)控AQP9表達(dá)還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)的深入研究。