臘梅葉醇提物二氯甲烷部位對阿爾茨海默病小鼠的影響*

郭佳晨，袁青青，丁永芳，陳 銘，劉曉龍，錢海兵△

(1. 貴州中醫藥大學，貴陽 550025； 2. 成都中醫藥大學，成都 611137)

阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)是一種表現出具有進行性特征的神經減退性疾病，該病最初發病征象不明顯，病程呈慢性進行性，臨床主要以記憶和認知功能障礙、語言和行為能力缺失為主要特征。研究認為，其發病與腦內產生Aβ的大量沉積[1]、機體抗氧化能力及抗炎能力減弱[2]、中樞膽堿能系統的異常[3]以及腦血流量的流速降低[4]等均有密切關系。

山臘梅(Chimonanthusnitens(Linn.)Link)是臘梅科臘梅屬落葉灌木。臘梅葉醇提物二氯甲烷部位是用乙醇從臘梅葉中提取得到臘梅葉醇提物后，再用二氯甲烷提取所得到的一種物質，極性相對較小且具有小分子的特征，在一定程度上可通過血腦屏障[5-7]。基于本課題組前期研究結果[8]，本實驗以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)、乙酰轉移酶(acetyltransferase，ChAT)為切入點，探討臘梅葉醇提物二氯甲烷部位對阿爾茨海默癥的影響，進而闡明其相關的作用機制，為臘梅葉深度開發和研發具有自主知識產權的治療阿爾茨海默癥新藥提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠雌雄各半，體質量25～35 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證書編號SCXK(渝)2012-0001。本實驗已通過貴州中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 試劑

D-半乳糖(北京索萊寶科技有限公司，批號0637)；臘梅葉醇提物二氯甲烷部位(自提)；氫溴酸東莨菪堿注射液(逐成藥業股份有限公司，批號H41021048)；吡拉西坦(杭州民生藥業有限公司，批號T18F007)；SOD測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20181220)；丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號20181226)；BCA法蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號 A045-3-2)；AChE測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號A105-1-1)；ChAT試劑盒(組織)(南京建成生物工程研究所，貨號A079-1-1)。

1.3 儀器

Morris水迷宮(長沙斯泰林生物科技有限公司)；恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；電熱恒溫箱(典銳化玻實驗儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(杭州科曉化工儀器設備有限公司)；電動勻漿機(德國IKA)；微量移液器(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

2 方法

2.1 供試品的制備

將采集來的臘梅葉陰干打成粗粉，取其粉末3600 g放入桶中，用75%的酒精將其浸沒，將桶蓋蓋好并用保鮮膜封好，將其浸泡12 h。取浸泡好的藥材粉末放入圓底燒瓶中，加粉末重量3倍的75%酒精(總體積不超過圓底燒瓶體積的1/2),將調溫電熱套溫度調至78～80 ℃之間，加熱至微沸開始計時，熱回流提取2 h過濾。將剩余濾渣再加3倍量的酒精，熱回流1 h 2次。將3次過濾所得的濾液放入旋轉蒸發儀的圓底燒瓶中，分離酒精與藥液減壓濃縮。用二氯甲烷萃取，將二氯甲烷層的萃取液放入旋轉蒸發儀的圓底燒瓶中，回收二氯甲烷減壓濃縮。將濃縮后的藥液于蒸發皿中蒸干，最后的浸膏量為103.6 g，得膏率為2.9%。給藥時用蒸餾水配置相應的濃度。

2.2 動物造模、分組及給藥

實驗開始前適應性飼養小鼠7 d。將108只KM小鼠按隨機數字表法分為(雌雄各半)空白對照組、模型對照組、陽性藥吡拉西坦(600 mg/kg)對照組、臘梅葉醇提物二氯甲烷部位高、中、低(350、175、87.5 mg/kg)劑量組6組各18只。除空白對照組注射等量生理鹽水外，其余各組均頸部皮下注射D-半乳糖[9](140 mg/kg)，連續4周，從第3周開始增加腹腔注射東莨菪堿(2 mg/kg)，連續2周。造模完成后開始給藥，其中臘梅葉醇提物二氯甲烷部位各組及陽性對照組開始灌胃給藥4周，每日1次，正常組和模型組每日根據體質量灌胃相應體積的蒸餾水。

2.3 Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶能力

給藥4周后，每天4次將小鼠進行定位航行實驗，實驗用時6 d。空間探索實驗室在定位航行實驗基礎上，于第7天將平臺取出水迷宮，將小鼠隨機從象限的中心點放入水中，記錄小鼠120 s內穿過原先放置平臺位置的次數，從而判定小鼠的記憶能力，完成水迷宮實驗。

2.4 檢測標本的制備

水迷宮實驗后，每組隨機抽取10只小鼠，采取摘除眼球取血，取血前先麻醉小鼠，操作符合動物福利的相關要求。取血后將裝有血液的試管放入離心機制備血清；在冰浴條件下將小鼠大腦中的海馬組織放入5 ℃水溫的生理鹽水中緩慢漂洗，后用濾紙吸干表面水分，稱取海馬組織的重量，按重量體積1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，機械勻漿需在冰水浴的條件下進行，2500 r/min，離心約10 min，吸取其上清液備用,同法提取肝組織勻漿液。

2.4.1 勻漿蛋白含量的測定 將雙蒸水、待測樣品、標準品以及工作液按規定放入空白孔、標準孔、測定孔中，嚴格按照BCA法蛋白定量試劑盒說明書，用紫外可見分光光度計測定各管吸光度值，測定海馬區腦組織勻漿和肝組織勻漿的蛋白含量。計算公式：總蛋白濃度(μg/ml)=(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(563μg/ml)×樣本測定前稀釋倍數。

2.4.2 SOD、MDA的測定 取AD小鼠的腦組織及肝組織的勻漿液及血清，將待測樣本、雙蒸水、酶工作液、酶稀釋液以及底物應用液按規定加入對照孔、對照空白孔、測定孔以及測定空白孔中，嚴格按照試劑盒說明書用紫外可見分光光度計測定各管吸光度值，計算出小鼠腦組織、肝組織、血清中SOD的活力以及MDA 的含量。計算公式：(1)組織SOD活性(U/mgprot)=(對照OD值-測定OD值)/對照OD值÷50% ×(反應液總體積/取樣量)÷待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml);(2)血清SOD活性(U/ml)=(對照OD值-測定OD值)/對照OD值÷50% ×反應體系的稀釋倍數×樣品測試前的稀釋倍數;(3)組織MDA含量(nmol/mgprot)=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(10 nmol/ml)÷待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml);(4)血清MDA含量(nmol/ml)=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(10 nmol/ml)×樣品測試前的稀釋倍數。

2.4.3 AChE、ChAT的測定 取AD小鼠的腦組織及肝組織的勻漿上清液，將試劑盒中的各個試劑、蒸餾水以及組織勻漿上清液按規定加入測定管中，嚴格按照試劑盒說明書用紫外可見分光光度計測定各管吸光度值，測量和計算出組織勻漿AChE和ChAT活性。計算公式：(1)組織勻漿AChE活性(U/mgprot)=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(1umol/ml)÷待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml);(2)組織勻漿ChAT活性(U/g組織濕重)=(測定OD值-對照OD值)/(反應時間<20 min>×1.98×10-2)×反應總體積(600ul)/取樣量(25ul)÷5%勻漿液濃度(g組織濕重/ml)。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 臘梅葉醇提物二氯甲烷部位對AD小鼠行為的影響

表1示，在小鼠在造模后模型動物的逃避潛伏期明顯比空白組用時明顯延長，穿過平臺次數明顯比空白組少，差異有統計學意義(P<0.05)，說明模型動物學習能力下降，造模成功。對模型動物分組給藥，在最后1次給藥結束后再次檢測。陽性藥組及給藥組的逃避潛伏期均有所縮短，穿過平臺次數均有所增加，說明陽性藥組及臘梅葉醇提物二氯甲烷部位組模型動物學習記憶能力改善，均取得了療效，其中給藥組高劑量組表現明顯(P<0.05)，說明在本實驗現有條件下，給藥組高劑量對改善AD小鼠學習、記憶及認知能力療效顯著。

表1 造模完成后及給藥結束后小鼠逃避潛伏期及穿過原平臺次數比較

3.2 臘梅葉醇提物二氯甲烷部位對AD小鼠SOD、MDA的影響

表2示，實驗小鼠腦組織SOD含量空白組最高，模型組最低，且差異有統計學意義(P<0.05)，說明造模成功；低劑量組、陽性藥組與模型組比較，SOD含量活性升高，其中給藥組、高劑量組效果最好(P<0.05)。各組小鼠腦組織MDA的含量與空白組比較，模型組明顯升高(P<0.05)。

表2 小鼠腦組織、肝組織、血清SOD、MDA數值比較

3.3 臘梅葉醇提物二氯甲烷部位對AD小鼠ChAT、ACHE的影響

表3示，與空白組比較，模型組AChE含量升高(P<0.05)；臘梅葉醇提物二氯甲烷部位低劑量組及陽性藥組與模型組比較，AChE含量降低，其中給藥組高劑量組效果最好(P<0.05)。與空白組比較，模型組小鼠腦組織ChAT含量明顯降低(P<0.05)；臘梅葉醇提物二氯甲烷部位低劑量組、陽性藥組與模型組比較，ChAT含量升高，其中給藥組高劑量組效果最好(P<0.05)。

表3 小鼠腦組織AChE、ChAT數值比較

4 討論

目前對于AD的臨床西藥治療主要包括抑制Aβ形成和沉積的藥物、膽堿能類藥、雌激素類藥物、促進腦代謝藥物等[10]，雖然在臨床運用也取得了一定的療效,但總體效果不太理想。近年來，中醫藥治療老年癡呆的臨床應用及科研方面已取得不少成果，但絕大部分相關研究仍停留在對AD的基礎研究階段，對治療AD的作用機制仍不肯定，選取的中藥常為臨床大量應用于癡呆疾病的經驗方。因此，明確AD的發病機制，同時找到抑制AD的新藥及其有效成分具有重要的理論及臨床研究價值。

早期對臘梅葉的藥理研究主要集中于揮發油及生物堿的藥理作用。前期研究發現，臘梅葉醇提物對癡呆小鼠具有一定作用，而其醇提物二氯甲烷部位在治療腦部疾病方面的研究較少[7]。因此，本研究將結合前期研究結果，在進行臘梅葉醇提物化學萃取的基礎上，進行臘梅葉醇提物二氯甲烷部位的抗AD研究。

SOD是體內消減自由基的一種主要起效酶類，其起效機理主要是催化生物氧化產生超氧自由基，消除并抑制自由基的連鎖反應過程，其與AD的形成密切相關。而MDA是自由基對生物細胞膜損傷的主要代謝產物，可讓生物膜產生變性及壞死，影響DNA的正常運轉，同時使機體內SOD活性降低，使自由基不斷地產生連鎖反應造成惡性循環，并最終引起AD等眾多老年病的發生[11]。AD的嚴重程度與膽堿能系統功能的損害程度密切相關，ChAT是乙酰膽堿的合成酶,可催化機體有關輔酶生成乙酰膽堿。ChAT的活性變化可間接反映乙酰膽堿在腦部組織中的合成水平;與ChAT不同,AChE是乙酰膽堿的分解酶,AChE的活性變化可間接表現出乙酰膽堿在腦部組織中的分解水平；ChAT和AChE共同維持著腦部組織中乙酰膽堿水平的相對平衡,體現了乙酰膽堿的代謝水平，水平低下則可導致學習及記憶障礙[12]。

本實驗表明，皮下大劑量注射D-半乳糖聯合東莨菪堿腹腔注射后，小鼠表現為學習記憶能力下降，腦組織勻漿中SOD活性降低，而MDA活性升高，可以認為成功誘導出AD癥狀。給予臘梅葉醇提物二氯甲烷部位后，小鼠的逃避潛伏期及穿過原平臺次數有顯著升高，說明其對改善AD小鼠的學習、記憶及認知能力具有明顯效果，且能減輕氧化損傷，亦可提高小鼠腦組織、肝組織、血清的SOD，降低MDA活性。

乙酰膽堿是機體中樞膽堿能神經系統中保持高級神經系統功能的一種重要物質。研究認為[13]，中樞膽堿能神經系統與機體的學習、記憶及認知緊密相關，AChE的作用是在機體內分解乙酰膽堿,在機體腦組織內的分布范圍很廣,與學習記憶功能緊緊相關，活性升高則會導致AD的產生并反映AD程度。而ChAT是合成乙酰膽堿的一種關鍵酶,主要存在于膽堿能神經元內,在細胞體內合成是衡量膽堿能神經元功能正常與否的重要標志[13]。本實驗表明，臘梅葉醇提物二氯甲烷部位可提高小鼠腦組織ChAT活性，降低AChE活性，從而改善小鼠的AD。

本實驗結果為臘梅葉醇提物二氯甲烷部位能改善AD小鼠的學習、記憶及認知能力，在一定程度具有抗AD的作用。其機制可能與提高小鼠腦組織、肝組織、血清的SOD，降低MDA的活性，提高小鼠腦組織ChAT的活性，降低AChE的活性有關，該研究結果為臘梅葉的深入研究提供了一定的實驗基礎與理論依據。