水產品中喹乙醇類藥物殘留檢測前處理條件的優化

修磊 楊翼羽 楊揚 李霞 楊立軍 唐詩 王義江

(1.吉林省長春市水產品質量安全檢測中心，吉林 長春 130000；2.長春市水土保持工作站，吉林 長春 130000；3.長春市水務局，吉林 長春 130000)

喹乙醇又名喹酰胺醇,是一類具有促生長作用的飼料添加劑,可以提高飼料轉化率和利用率,治療和抑制魚病的發生,對于魚類的敗血癥等病癥有著良好的防治作用。但是為了追求產量和成活率,大量的使用喹乙醇會引起中毒和導致畸形,因此檢測該藥的殘留便被廣泛關注,很多國家對于喹乙醇在養殖和治療防治方面已經明令禁止。目前我國對于喹乙醇的檢測主要依據液相色譜法進行檢測,本文通過對喹乙醇前處理步驟的優化,使得所檢測的試驗結果靈敏度更高,結果更精確,以滿足水產品檢測以及相關研究的要求[12-28]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與設備

玻璃砂芯漏斗、高速均質機、旋蒸儀、離心機、漩渦混勻器、Agilent 1100 (配有紫外檢測器) 高效液相色譜。

1.1.2 試劑與藥品

色譜級別的乙腈、正己烷、甲醇、喹乙醇標準品、助濾劑。

1.1.3 樣品及其制備

取出魚、蝦、蟹、鱉等水產品肌肉部分,除凈脂肪和結締組織,樣品經過簡單處理后待用,測試前解凍,均制成肉糜狀。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

精確稱取喹乙醇標準品用甲醇定容為10μg·mL-1,需置于棕色容量瓶內避光冷藏保存,保存期為1 個月。

1.2.2 工作曲線的制備

將標準品稀釋成適當的濃度梯度,進行圖像采集,工作曲線的縱坐標為峰面積,樣品含量為橫坐標,制作曲線圖譜。樣品的出峰時間約為4.0min。

1.2.3 色譜條件

色譜柱、流動相、色譜溫度以及檢測波長按照標準執行。

1.2.4 加標樣品的制備

稱取待測樣品空白樣適量,加入標準品溶液,各樣品作2 個平行樣,根據公式計算得到加標濃度為20μg·kg-1。

1.2.5 數據的統計分析

采用SPSS 17.0 統計軟件進行多因素方差分析,并應用LSD 多重檢驗比較各水平的均值,差異顯著性水平(P) 值設定在0.05。

2 前處理的單因素試驗

2.1 樣品加標及旋渦混懸提取

精確量取喹乙醇標準溶液置于待測魚糜中充分混勻。精確稱取待測加標樣品置于50mL 離心管中,再經過助溶、乙腈提取、旋渦混懸混勻、離心重復操作合并上清液[2,5,8,11,12]。

2.2 乙腈提取物減壓濃縮

將合并后上清液經正己烷凈化后置于雞心瓶中,減壓濃縮后用流動相溶解殘渣,經濾膜過濾后待用[2,5,8,11,12]。

表1 前處理單因素試驗及水平

3 結果

3.1 喹乙醇標準曲線及標準液相色譜圖

喹乙醇的標準曲線見圖1,線性良好,喹乙醇的標準曲線數據見圖2。

3.2 加標量對喹乙醇殘留加標回收率的影響

不同加標量下待測樣品液相色譜圖分別見圖3～5,回收率結果見表2。

表2 不同加標量下回收率結果

根據標準曲線,計算結果顯示加標量為20μg·kg-1時回收率最高。

3.3 乙腈提取物減壓濃縮時間對喹乙醇類藥物殘留加標回收率的影響

3 次不同減壓濃縮時間下待測樣品液相色圖譜分別見圖6 至圖8,回收率結果見表3。

表3 不同減壓濃縮時間下回收率結果

根據標準曲線,計算結果顯示乙腈提取物減壓濃縮時間為15min 回收率最高。

3.4 旋渦混懸時間對喹乙醇類殘留加標回收率的影響

不同旋渦混懸時間下待測樣品液相色圖譜分別見圖9 至圖11,回收率結果見表4。

表4 不同旋渦混懸時間下回收率結果

根據標準曲線,計算結果顯示旋渦混懸時間在7min 時回收率最高。

3.5 多因素方差設計及分析

在單因素試驗的基礎上進行3 因素3 水平的方差分析,所選的因素見表5,SPSS 多因素方差設計及分析[28-30]見表6～11,圖12。

表5 選用因素水平

表6 多因素方差設計方案及結果

表7 多因素方差主體效應的檢驗

表8 估算邊際均值加標量

表9 減壓濃縮時間

表10 旋渦混懸時間

表11 LSD 多重檢驗

因素A 代表加標量；因素B 代表乙腈提取物減壓濃縮時間；因素C 代表樣品旋渦混懸時間；1、2、3分別代表3 個水平；P 代表差異顯著性。結果分析表明,因素A 和C 的P 值分別為0.179 和0.117,均對回收率的作用不明顯(P ＞0.05),因素B 的P 值為0.020,具有顯著作用(P ＜0.05),因此最優組合優先選用因素B。通過對因素B 的多重比較,水平3 顯著優于其它兩組(P＜0.05)。由于因素A 和C 無顯著影響(P＞0.05),故可選擇邊際均值最優進行組合為A2B3C2。

4 結論

SPSS 多因素方差優化得到的最佳前處理條件是加標量20μg·kg-1,乙腈提取物減壓濃縮時間15min,旋渦混懸時間5min。