豬流行性腹瀉病毒在美國的流行及其檢測方法的研究進展

陳梅娟，張志誠，李繼東

(1.寧夏大學農學院,寧夏 銀川 750021；2.中國動物衛生與流行病學中心,山東 青島 266032)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)為尼多病毒目、冠狀病毒科、α-冠狀病毒亞屬成員[1]，可引起新生仔豬發生以急性腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率為特征的接觸性腸道傳染病，即豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)。20世紀70年代初，PED首次出現在英國，隨后迅速傳至西班牙等其他歐洲國家[2]。2013年5月 美國首次發現PED，且其迅速傳播，導致美國31個州的商業豬存欄數量在18個月內損失10%[3]。PEDV作為一種感染豬并導致高死亡率的冠狀病毒，雖無直接證據表明其和目前全球流行的新型冠狀病毒SARS-CoV-2有直接關聯，但其作為冠狀病毒科、α-冠狀病毒亞屬成員，在遺傳變異、致病力、傳播擴散以及宿主選擇等方面存在極大的不確定性，同時其也是國際貿易，尤其是當前中美生豬及豬肉貿易中具有重要檢疫意義的病原微生物。為此，本文在分析美國豬群PED監測和檢測情況的基礎上，對PEDV病原學、檢測方法等方面的研究進行綜述，以期為從美國的生豬及豬肉制品入境及其檢疫監測技術提供支持。

1 PEDV簡介

1.1 病原學 PEDV基因組是單股正鏈RNA，基因組全長約28 kb，主要由3個部分組成，包括5′端非編碼區(5′-UTR)，3′端非編碼區(3′-UTR)，7個開放閱讀框(ORF1a，ORF1b，ORF2～6)[4]。ORF共編碼16種非結構蛋白、4種結構蛋白和1種輔助蛋白?；虻捻樞蚍謩e為：5′-ORF1(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3′。ORF1a和ORF1b是位于5′端的2個重疊的開放閱讀框，約占據病毒全基因組的2/3，ORF1a和ORF1b共同編碼的多聚蛋白(Polyprotein，PP1ab)在翻譯后期被程序性切割而產生16種非結構蛋白(Nsp1～Nsp16)，主要參與病毒的復制和轉錄過程。ORF2、ORF4～6分別編碼4個結構蛋白(S、M、E、N)，其中S蛋白是PEDV的主要表面抗原，能夠介導病毒進入宿主細胞，并且刺激宿主產生中和抗體；M蛋白為跨膜蛋白，在病毒裝配以及出芽的過程中起到重要作用；E蛋白是PEDV病毒粒子中最小的結構蛋白，主要參與病毒的組裝并在病毒的出芽期發揮重要作用；N蛋白具有高度的保守性，其抗原決定簇是誘導機體免疫的重要組成成分，可誘導強烈的細胞免疫反應。ORF3編碼輔助蛋白，與PEDV的細胞適應性及病毒毒力有關，并且ORF3基因序列分析可以用來區分疫苗和野生型PEDV[5]。然而，Wang等[6]研究發現，在低致病性弱毒疫苗株中，ORF3基因的49 bp缺失將不再是區分經典減毒疫苗和野毒株的可靠標準。目前已知的PEDV僅有1個血清型，但是根據S基因可以將PEDV分為1型基因群(G1)和2型基因群(G2)，每種基因群中均可分為2個亞型，分別為G1a與G1b亞型和G2a與G2b亞型。

1.2 傳播途徑 患病豬是PEDV的主要傳染源。此外，攜帶PEDV的野豬是病毒的儲存宿主，對該病的流行和傳播具有重要作用[7]。PEDV主要通過直接或間接接觸以及氣溶膠進行傳播。糞-口途徑，即通過直接接觸感染豬的糞便和/或嘔吐物傳播，是PEDV傳播的主要途徑。PEDV在農場內和農場之間的間接接觸傳播也很頻繁，特別是在生物安全性較低的情況下，通過其他受污染的媒介傳播，如運輸拖車、農場工人的手、靴子和衣服、飼料、飼料成分和添加劑以及用于運輸散裝飼料的包裝袋等[8]。糞便-鼻腔途徑是PEDV通過氣霧化形成顆粒，這種病毒顆粒在哺乳豬中具有傳染性，是該病傳播的另一種途徑[9]。

2 PEDV在美國的流行

2.1 流行史 PED最早于1971年在英國被記錄為1種類似于傳染性胃腸炎的疾病。1978年，PED的病原在比利時被鑒定為1種新的冠狀病毒，并被命名為PEDV，原型株為CV777[2]。20世紀70—80年代，PEDV在歐洲廣泛傳播，如英國、比利時、捷克共和國、匈牙利、法國、瑞士、德國和意大利等國家均有報道。在亞洲，這種病毒于1982年首次在日本被發現，并傳播到包括韓國、中國、泰國和越南在內的幾個國家和地區，由于其對養豬業的影響較小，并未引起人們足夠的重視。2010年，PEDV毒株變異導致PED發病率顯著提高，造成大量哺乳仔豬死亡，給養豬業造成了嚴重損失后，學者們才開始對PEDV的突變和重組進行深入的研究。2013年，PEDV傳入北美，最初在美國發現，隨后傳播到加拿大和墨西哥。2014年夏季，烏克蘭暴發豬流行性腹瀉疫情，10日齡以下仔豬受到嚴重影響，死亡率接近100%[10]。隨后，在德國、葡萄牙、法國、荷蘭、意大利和比利時也發現了與仔豬水樣腹瀉相關的PED暴發[11]。如今，PED已經成為世界范圍內的流行病，分布在德國、越南、日本、美國等國家和地區，給全球養豬業造成了巨大的經濟損失。

2.2 PEDV在美國的流行狀況 2013年5月，美國愛荷華州暴發了PED，對歷史樣本的檢測則顯示，此前1個月俄亥俄州就已發生了PEDV感染。到2014年9月底，PEDV在全國范圍內迅速傳播，并在32個州的農場得到證實[12]。這次疫情的暴發導致超過700萬頭仔豬死亡，造成9億～18億美元的經濟損失。截至2017年12月，已經有39個州和超過3 750個場所被確認為PEDV陽性[13]。在美國，PED是由PEDV的2個不同基因型(G)引起的，即S INDEL(G1b)和非S INDEL(G2b)毒株[12]。而且有學者發現，美國的所有PEDV毒株都聚集在2a亞組的1個分支中，并與來自中國的1個毒株(AH2012)密切相關[14]。Su等[15]從2016—2017年在美國采集的豬糞便和口腔液樣本中檢測到4種類型的PEDV變異株，這些變異株的S蛋白存在大量缺失，同時還檢測到美國CV777毒株，這是美國首次發現S1 NTD-del PEDV變異株與美國原型毒株的共感染現象。2017年2月，Zhang等[16]在俄克拉荷馬州1個 母豬養殖場發現1種PEDV變異株(USA/OK10240-8/2017)，全基因組序列分析表明，其S基因N端結構域有1個連續的600nt(200aa)缺失，這是美國首次在臨床豬樣本中檢測到PEDVS基因的大片段缺失。冠狀病毒S基因的突變，尤其是堿基的插入和缺失，可能會改變冠狀病毒的致病性、抗原性和組織嗜性，并且變異毒株的不斷出現，也為PEDV的防控增加了難度。

美國豬病監測報告系統(Swine Disease Reporting System,SDRS)2020年的分析[17]顯示，2019—2020年度美國養殖豬群中的PEDV陽性率分布維持在1個較為寬泛的統計區間。2019年上半年各月份監測結果顯示，PEDV的核酸檢測水平與2018年度同期持平，所有年齡組的陽性檢出率均略為下降。2019年9月份PEDV的陽性檢出率為12.98%，與8月份基本一致。其中成年/母豬養殖場的PEDV陽性檢出率為5.24%，為PEDV進入美國以來的歷史最低水平。但在10—12月份，PEDV 陽性檢出率則持續上升。2019年12月，PEDV陽性檢出率升至15.64%。12月1—14日，PEDV RNA的檢測水平高于歷史同期預期水平，這可能主要是由愛荷華州市場的斷奶動物病例增多造成的。2020年1月份PEDV陽性檢出率較2019年12月份有較大幅度上升，其中明尼蘇達州和北卡羅來納州的陽性檢出率最為顯著，而2020年2—5月的監測顯示，各州中豬各年齡組的PEDV陽性檢出率都有所下降，可能和這期間獸醫公共衛生服務強度及豬群監測范圍大小和取樣數量等有一定關聯?？傮w上看，PEDV在養殖豬群中的分布隨生豬出欄數量、生長育肥階段和各地區養殖狀況不同而有較大差異。

Bowman等(2015年)[18]和Scott等(2016年)[19]研究認為，美國PEDV的發生是養殖豬群的感染發生在先，然后傳播擴散到了野生豬群，這一結論的證據是野生豬群監測的PEDV核酸陽性要比養殖豬群的PEDV核酸陽性的出現晚1年以上。為了調查美國現階段野生豬群PEDV的感染狀況，Bevins等[20](2018年)用基于全病毒建立的PEDV-ELISA檢測方法，對來自美國37個州的7 997份野豬血清樣品進行了檢測，結果發現共有253份血清樣品呈冠狀病毒陽性，陽性率為3.2%。由于PEDV-ELISA方法對豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)產生交叉反應，所以又使用了基于PEDV S1蛋白建立的熒光微球免疫分析(FMIA)檢測方法對這253份陽性樣品進行了額外的篩查，其中8份呈PEDV陽性，陽性率為0.1%，另外245份陽性樣品可能感染了TGEV。

2.3 其他冠狀病毒 冠狀病毒科由4個屬組成：α冠 狀病毒、β冠狀病毒、γ冠狀病毒和δ冠狀病毒。α屬的代表性成員有PEDV、TGEV、豬呼吸道冠狀病毒(Porcine despiratory corouavirus,PRCV)、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。δ屬的成員有豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)。PEDV、TGEV和PDCoV感染豬后主要引起腸道感染，PRCV易感染呼吸道。豬感染腸道冠狀病毒對豬群健康危害極大，但其對公共衛生的不確定性影響只是近期才被廣泛關注。TGEV于1946年在美國首次報道，能夠引起豬的傳染性胃腸炎，常導致2周齡以內的哺乳仔豬因嘔吐和嚴重腹瀉而死亡[21]。雖然TGEV和PEDV經常發生共感染并導致嚴重的流行性疾病，但是這2種病毒抗原性不同，不存在交叉保護。PRCV最早于1984年在比利時發現，是TGEV的S基因缺失突變毒株[22]，形態學上與TGEV相似，主要在扁桃體和呼吸道復制，可以引起豬肺炎。2014年，在美國腹瀉豬中檢測到1種新的δ冠狀病毒，即PDCoV，臨床表現與PEDV、TGEV感染相似。生產中多見由PDCoV與PEDV、TGEV混合感染導致的豬腹瀉性疾病。PDCoV基因組結構與PEDV等冠狀病毒相似，但與PEDV基因排列順序不同的是PDCoV的NS6位于M基因和N基因之間，NS7位于N基因的ORF中[23]]。2016—2017年，在中國的腹瀉豬中發現了另1種新的α冠狀病毒(類似于bat-HKU2)，它的基因組序列與PEDV等冠狀病毒的序列存在差異，但在臨床上與其他病毒感染相似，被命名為SADS-CoV[24]。

3 PEDV的檢測方法及其選擇

3.1 檢測方法的研究

3.1.1 環介導等溫擴增技術(LAMP)LAMP是一種簡單、特異、經濟高效的核酸擴增方法。Yu等[25]為了在缺少設備的豬場實現快速檢測，建立了PEDV實時RT-LAMP 檢測方法，最低可檢測的病毒量為0.07 PFU，比一步法RT-PCR敏感100倍，與實時RT-PCR 敏感性相當。然而，在LAMP試驗中使用的熒光染料常常會引起假陽性結果，且開蓋檢測很容易發生氣溶膠污染。隨后，有學者針對以上問題，將垂直流(VF)核酸檢測試紙條置于可視化條帶盒的密封塑料裝置中以控制擴增中產生的污染，并與RT-LAMP檢測技術相結合，建立了RT-LAMP-VF PEDV檢測方法，該方法有較好的特異性，檢測最低限為10 pg RNA，可在PEDV臨床診斷中推廣應用[26]。隨著檢測要求的不斷提高，Zhou等[27]建立的微流控RT-LAMP芯片檢測系統，可同時檢測和鑒別診斷PEDV、PDCoV和SADS-CoV，特異性為100%，敏感性分別為92.24%、92.19%和91.23%，最低檢測限分別為10拷貝/μL，并且其快速、便攜、低成本的特點，適合在偏遠地區推廣。

3.1.2 免疫層析技術(ICA)ICA是20世紀末發展起來的一種快速診斷技術。為了對PEDV感染做出早期診斷，進而采取嚴格的生物安全措施以及疫苗接種等措施以控制PEDV的傳播和蔓延。Liu等[28]研發了基于聚苯乙烯Eu(III)螯合物微粒的橫向流動試紙條(LFTSs)，可定量分析糞便拭子中的PEDV N蛋白。該方法的敏感性和特異性為97.8%和100%，最低病毒檢測限為10 TCID50/mL。為了降低背景熒光的干擾性，Xu等[29]研發了基于EuNPs-mAb熒光探針的免疫層析試紙條(ICA)，該方法最低可檢測病毒量為2.725×103TCID50/mL，樣品檢測與RT-PCR的一致性為86.67%。除了適用于PEDV抗原檢測的方法，還有學者建立了可檢測初乳中PEDV抗體的免疫膠體金檢測方法。Liu等[30]以純化的G2基因型PEDV-LNCT2顆粒作為捕獲抗原，建立了可檢測初乳樣品中PEDV抗體的免疫膠體金檢測方法。這種方法不僅可以同時檢測G1和G2基因型毒株，還能通過測定SIgA水平監測豬群感染和免疫狀態，為PEDV流行病學監測和疫苗免疫研究提供了簡便、靈敏、特異的檢測手段。

3.1.3 聚合酶鏈式反應檢測技術(PCR)常規和實時逆轉錄聚合酶鏈反應(rRT-PCR)等分子診斷方法與傳統的其他方法相比具有更高的診斷敏感性和特異性，是實驗室診斷PEDV的首選方法。美國大多數獸醫診斷實驗室在收到臨床樣本后24 h內報告rRT-PCR結果，因此可以快速實施干預和控制措施，以降低病毒進一步傳播的風險。當前PEDV在全球逐漸呈現經典和變異毒株共同流行的復雜態勢，為PEDV的診斷和防控增加了一定的難度。Su等[31]根據此流行態勢建立了新型的基于TaqMan探針的雙重實時RT-qPCR，用于檢測和區分PEDV經典和變異毒株。隨著儀器的革新和納米技術的應用，多種PCR優化及衍生方法被建立，如Luo等[32]建立的基于功能化磁珠富集和特異性納米技術擴增的雙重超靈敏納米粒子DNA探針的PCR(dual UNDP-PCR)方法，能同時檢測和鑒別診斷PEDV和TGEV。雙重UNDP-PCR對PEDV和TGEV單次或多次感染的檢出限為25拷貝/g，比目前已知的雙重RT-PCR敏感性高400倍，表現出更好的特異性和敏感性，且不與其他病毒發生交叉反應。目前，基于PCR的檢測方法主要用于檢測疑似感染該病毒動物的糞便、直腸拭子或腸道樣本中的PEDV基因組。為此，Puente等[33]建立了RT-qPCR方法，能夠快速選擇性檢測熱處理后可能感染的PEDV，用于推斷其傳染性，在養豬業飼料成分監測方面也具有潛在應用價值。

3.1.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)ELISA是免疫學檢測中應用最廣泛的方法之一，一直被作為血清學檢測的標準方法，可用來檢測PEDV的抗原和抗體。PEDV捕獲ELISA試劑盒已被開發用于檢測糞便樣本中的PEDV。然而，臨床樣本中病毒的檢測可能受到幾個因素的影響，包括樣品采集的時間、樣品儲存條件和運輸溫度。因此，建議在感染急性期，即出現臨床癥狀后不久就采集樣本，并低溫運送至實驗室。有研究者建立了間接ELISA來評估口腔液中是否存在PEDV特異性IgG和IgA抗體[34]。Okda等[35]建立并驗證了幾種檢測PEDV抗體的血清學檢測方法，包括基于N蛋白的間接和阻斷ELISA。結果表明，這些方法之間具有良好的相關性，并呈現出類似的診斷敏感性和特異性(iELISA分別為97.9%和97.6%；bELISA分別為98.2%和98.0%)。與間接ELISA相比，阻斷ELISA的主要優點是其特異性更高，其檢測特異性取決于阻斷抗體的亞型及其對靶抗原的特異性。

目前建立的間接ELISA方法，一般是通過原核表達系統表達重組病毒蛋白(S、N 和 M)，用于包被抗原的大量生產。但是，使用原核表達系統表達的蛋白質可能缺少適當的蛋白質折疊以及翻譯后修飾(例如糖基化)，進而影響蛋白的生物活性，這可能導致ELISA試劑盒的敏感性和特異性降低。針對這個問題，Chang等[36]在人胚胎腎(HEK)-293細胞分別表達S基因的全長及其截斷蛋白，以此建立了2種間接ELISA方法，與基于N蛋白的商用ELISA試劑盒相比，基于全長S蛋白的ELISA的敏感性為97.8%，特異性為94%，基于截斷S蛋白的ELISA的敏感性更高，為98.9%，特異性為99.1%。目前建立的用于PEDV診斷的間接ELISA方法，非常耗時且昂貴，而納米抗體其易于表達和高度穩定性的優勢可以克服這些問題，為此Ma等[37]建立了基于生物素化的納米抗體新型封閉ELISA(bELISA)，并用該方法對150份臨床血清樣品進行了檢測，bELISA的靈敏度和特異性分別為100%和93.18%，與商用ELISA試劑盒的符合率為94%。

3.2 檢測方法的選擇與評估 豬的4種腸道冠狀病毒感染引起的臨床癥狀難以區分。因此，鑒別診斷是控制豬病毒性腹瀉的關鍵技術環節。特別是對區間移動以及生豬和豬肉貿易中的風險控制與口岸監測篩查而言，選擇合適的檢測試劑和方法，是降低PEDV傳入風險的最重要手段。敏感性更高的診斷測試可以提供更高的置信度來解釋樣品的污染/感染狀態，故而最低檢測限-分析敏感性(Analysis sensitivity,ASe)和臨床診斷敏感性(Diagnosis sensitivity,DSe)在監測技術的選擇中應綜合考慮[38]。當樣品病毒含量接近最低檢測限時，陽性檢出的不確定性會非常大，同時也預示著樣品來源場感染風險的極大不確定性。在出口貿易檢疫監測中，針對此類風險，一是增加抽樣監測的數量，二是需要重復多次開展檢測。當前，基于PEDV免疫反應的不同血清學檢測方法使用較為廣泛，但每種檢測方法都有其優缺點。因此，一套完整的測試方法有助于PEDV抗體的初步鑒定和高效、高通量的定量分析。Okda等[35]在iELISA、bELISA和FMIA之間觀察到相似的Kappa值，表明這3種檢測方法之間存在顯著的一致性。Gimenez-Lirola等[39]研究發現，感染后基于全病毒的ELISA檢測到的IgG抗體比IFA檢測的時間長。檢測PEDV抗體不僅能反映出抗體的分布和豬群的免疫水平，而且能反映未經免疫的豬群的感染史，因為抗體在豬體內的持續和存在時間要比PEDV病毒在豬體內排毒時間更長[2]。所以，PEDV的抗體檢測試劑也可以用于對PEDV流行病學的回顧性研究。然而，PEDV毒株的進化是一個連續過程，目前已經發現了多個PEDV變異毒株。針對不同毒株單個抗原誘導產生的抗體，用任何一種抗體檢測試劑進行檢測，對其效率的評估是不可或缺的，但鮮有相關報道。故而在口岸入境監測檢測中，不僅需要選擇合適的檢測方法和試劑，同時試劑的準確性、可靠性和有效性等驗證參數，如分析敏感性(Analysis sensitivity,ASe)、分析特異性(Analysis specificity,ASp)、檢測敏感性(Diagnosis sensitivity,DSe)、檢測特異性(Diagnosis specificity,DSp)、參考樣品的選擇和數量等，也是必需要考慮的重要因素。

4 結語

美國豬病監測研究[17]顯示，2019—2020年度美國豬群中的PEDV表觀陽性率分布維持在1個較高的統計區間(P=0.035 0～0.253 0)，其分布值隨生豬出欄數量、生長育肥階段和各地區養殖狀況不同而有較大差異。而且從監測研究中可以看出，PEDV感染對仔豬危害尤其大，死亡率超過50%，而成年豬感染后的死亡率較低。生豬移動以及豬肉制品的貿易交流是PEDV傳播和擴散的主要方式。來自中國海關及有關口岸監測的數據顯示，近些年來，中國與美國生豬以及豬肉貿易交流非常頻繁且數量巨大，故而美國PEDV毒株通過生豬出口以及豬肉貿易交易傳入我國的可能性很大，需要加強檢測方法的研發、監測疫情并進行風險分析與評估。