布魯氏菌持續性感染機制研究進展

張 倩 , 孫天浩 , 張 輝 , 陳創夫 , 王 震

(1.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所 ， 新疆 石河子 832000 ; 2.石河子大學動物科技學院 ， 新疆 石河子 832000 ； 3.西部地區高發人獸共患傳染性疾病防治協同創新中心 ， 新疆 石河子 832000)

布魯氏菌是一種兼性胞內寄生菌，其引起的布魯氏菌病(Brucellosis)是一種嚴重危害人和家畜健康的人獸共患傳染病，可以引起人的波浪熱，母畜流產以及公畜睪丸炎等癥狀，嚴重阻礙畜牧業的發展和公共衛生安全[1]。布魯氏菌沒有經典的毒力因子，如莢膜、外毒素、菌毛和質粒等，在長期進化過程中，布魯氏菌從一種營自由生活的古細菌進化成為胞內寄生的病原菌，最終演化為具有宿主偏好性的不同種布魯氏菌。同時，布魯氏菌通過弱化毒力，形成了一系列“隱藏”策略，躲避宿主細胞的殺傷以及逃逸宿主的抗感染免疫，從而可以在宿主體內長期存活，建立持續性感染[2]。因此，深入了解布魯氏菌適應性調節能力，尤其是布魯氏菌的免疫逃逸能力，將有助于理解胞內病原菌的致病機制，為防治布魯氏菌的相關疾病研究提供理論基礎，并對抗病原微生物感染藥物的研發具有重要意義。

1 布魯氏菌對胞內微環境的適應

1.1 對氧化損傷的抵抗 宿主細胞產生的ROS(如O2-和H2O2)對于胞內布魯氏菌的殺傷和酸化至關重要。然而，布魯氏菌胞質中的超氧化物歧化酶可以保護細菌抵抗內源性的O2-，使其難以穿過細菌的細胞膜，從而發揮隔離防護作用。另外，胞質中的SODs(SodA、SodB等)可通過有氧代謝途徑抵抗內源性O2-。研究發現，布魯氏菌產生的SodC能夠保護牛種布魯氏菌2308抵抗宿主細胞的氧爆發作用，而且是建立小鼠慢性感染所必需的毒力因子。布魯氏菌周質中的過氧化氫酶KatE和AphC是抑制內源性H2O2的主要抗氧化劑，KatE具有排出超生理限度H2O2的作用，而AphC似乎是內源性H2O2的主要清除劑[3]。布魯氏菌除了具有逃避ROS殺傷能力外，也具有間接避免氧化損傷的機制。在其他細菌中已經被證實，細胞色素氧化酶和細胞色素C對O2-具有高親和力，而且O2-“清除”細胞色素氧化酶的能力與ROS的毒性密切相關[4]。在細胞模型和動物模型中，細胞色素氧化酶和細胞色素C對于布魯氏菌生存是必需的，而且在所有活細胞中，DNA是ROS介導細胞殺傷的主要靶標，已有研究顯示：DNA修復途徑在保護布魯氏菌體外免受ROS殺傷過程中發揮著重要作用[5]。

1.2 對亞硝基化損傷的抵抗 在小鼠巨噬細胞中，一氧化氮合酶(iNOS)產生的一氧化氮(NO)對控制胞內布魯氏菌的繁殖發揮著重要作用[6]。布魯氏菌產生的一氧化氮還原酶(Nor)除了具有反硝化的代謝作用外，也對胞內布魯氏菌繁殖過程中NO的排出發揮重要作用。ROS-RNI復合物被認為是宿主巨噬細胞抗菌庫的重要組成部分，具有高效的殺菌活性。沙門菌、分枝桿菌和幽門螺旋桿菌的AhpC蛋白已證實具有過氧化亞硝酸鹽還原酶的活性[7]。而在布魯氏菌的研究中，AhpC突變株可增加體外布魯氏菌對過氧化亞硝酸鹽ONOO-的敏感性，但是布魯氏菌的AhpC蛋白是否具有保護細菌免受ONOO-殺傷的作用還有待于進一步證實[8]。

1.3 對酸性pH的抵抗 布魯氏菌感染宿主細胞的早期階段，布氏小體發生酸化，布魯氏菌virB基因編碼的IV型分泌系統在布氏小體的酸化過程中發揮著重要作用[9]。隨著研究的深入，與布魯氏菌抗酸特性相關的分子被不斷的發掘和發現，胞質分子伴侶HdeA被證實在大腸桿菌和志賀氏菌的抗酸過程中發揮重要作用[10]。牛種布魯氏菌hdeA基因缺失后，其抵抗酸性pH的能力顯著降低，但該突變株在小鼠模型中毒力并未降低[11]。布魯氏菌Ca2+結合蛋白Asp24與RNA分子伴侶Hfq參與了布魯氏菌對酸性條件的調控，但其調控機制尚未明確[12]。對布魯氏菌的比較基因組學研究發現，大多數布魯氏菌具有脲酶基因，不僅可以抵抗極低pH(pH=2)環境，而且也可保護布魯氏菌口服疫苗抵抗宿主胃腸道中的酸性條件。然而也有研究表明，脲酶并不具有保護布魯氏菌在宿主細胞內抵抗酸性條件的作用[13]。

1.4 對抗菌肽的抵抗 布魯氏菌相對于其他革蘭陰性菌具有更高的抵抗胞內陽離子肽的能力，這種能力與布魯氏菌脂多糖(LPS)脂質的酰基化有關，可保護細菌降低與溶酶體融合過程中裂解肽的殺傷作用[14]。

1.5 對營養脅迫的抵抗 布魯氏菌在宿主細胞內生存繁殖會遭遇營養脅迫作用，O2是宿主限制的主要營養物質之一，細胞色素氧化酶或脫氮途徑有助于布魯氏菌在低濃度O2條件下進行呼吸作用。碳水化合物的運輸和代謝途徑是布魯氏菌胞內繁殖所必需的，而牛種、羊種布魯氏菌能夠利用赤蘚糖醇作為替代碳源[15]。金屬離子攝取系統不僅是布魯氏菌重要的毒力因子，也是病原菌在長期進化過程中應對金屬離子極度匱乏形成的一套適應機制。近年來，大量的證據證明Fe2+、Mg2+、Zn2+和Mn2+的高效運輸對于布魯氏菌的胞內存活至關重要[16]。

2 布魯氏菌調控胞內運輸途徑

布魯氏菌通過非調理作用侵入宿主細胞后，含有布魯氏菌的液泡(BCVs)，又稱為布氏小體，通過胞內運輸途徑最終到達其復制區域。在胞內運輸的初始階段BCVs與溶酶體短暫接觸，導致其迅速酸化，隨后與內質網(ER)發生相互作用，使胞內pH上升以有利于布魯氏菌的復制繁殖。而在上皮細胞中，BCVs具有類似于自噬體的功能，自噬可能是一種宿主防御機制，用于對抗侵襲的布魯氏菌[17]。但目前研究顯示，布魯氏菌誘導的非典型自噬，有利于布魯氏菌逃避宿主細胞的殺傷，從而達到復制的目的[18]。布魯氏菌毒力因子VirB由12個基因構成，編碼布魯氏菌IV型分泌系統，VirB操縱子可被BCVs的酸化作用特異性激活。布魯氏菌VirB突變株侵襲細胞時，具有與野生型布魯氏菌相同的侵襲能力，證明其不是布魯氏菌侵襲所必需的，但在宿主細胞中，VirB對調控布魯氏菌胞內運輸及生存必不可少[19]。

β-環葡聚糖(cβG)是調控布魯氏菌胞內運輸的另一個關鍵分子，β-環葡聚糖在布魯氏菌胞質中含量豐富，可調節細胞膜的滲透壓[20]。布魯氏菌cβG突變株毒力明顯減弱，不能逃避胞內溶酶體的融合，其作用機制可能是由于cβG分子通過減少脂筏中的膽固醇，調節BCVs中的脂筏組分，改變了吞噬泡與溶酶體相互作用構象。cβG的分子結構與β-環 糊精分子相似，而β-環糊精分子對膽固醇和鞘脂的親和性較高，β-環糊精分子可破壞脂筏，導致細胞裂解。而cβG分子相對于β-環糊精分子具有較低的膽固醇分子親和性，盡管它可以擾亂脂筏，但它對細胞無毒性作用，也不會裂解細胞。而且cβG分子不依賴于VirB系統轉運，也不存在于布魯氏菌脫落的外膜成分中[21]。因此，cβG分子被釋放到BCV中的方式仍有待深入研究。目前科學家推測：部分細菌在宿主細胞內死亡相對大量的cβG分子被釋放到吞噬泡中，從而幫助其他胞內布魯氏菌逃避殺傷并轉移到生長繁殖位點。該假說目前已通過兩方面得以證明：(1) 巨噬細胞只允許一小部分內化的布魯氏菌到達內質網；(2)在受感染的細胞中添加外源性cβG分子能夠使布魯氏菌cβG突變株免受溶酶體的融合。

3 布魯氏菌調控細胞凋亡

操縱細胞程序性死亡是病原體促進其在宿主內生存的主要機制之一。細菌病原體如貝氏柯克斯體或鼠傷寒沙門菌，可以干擾細胞程序性死亡通路，以支持細菌特定感染階段的活動。目前研究表明，布魯氏菌感染早期可抑制宿主細胞的凋亡，表明布魯氏菌已經進化出避免宿主細胞過早死亡的策略，進而達到持久胞內生存繁殖的目的。

在相同組織細胞培養物中，感染布魯氏菌的細胞生存時間比未感染的細胞顯著延長，且只有活菌感染才能實現布魯氏菌的凋亡保護作用[22]。另外，凋亡保護作用的實現需要TLR4或TLR2的參與，在這兩種受體同時缺失的情況下，受感染巨噬細胞的壽命銳減；而且Myd88缺失的巨噬細胞其壽命也未被延長，這表明巨噬細胞抗凋亡需要細胞因子的參與[23]。同時研究發現，布魯氏菌O-鏈多糖可抑制巨噬細胞凋亡，從而有利于胞內細菌的存活。然而，純化的Br-LPS進入宿主細胞后，抑制凋亡的現象未能出現，說明凋亡抑制作用與粗糙型布魯氏菌Br-LPS的分子結構和生理變化有關[24]。

4 布魯氏菌逃避先天性免疫應答

布魯氏菌是從營自由生活的α-變形桿菌屬進化成為胞內寄生菌的過程中，其基因組逐漸縮小、細菌質粒被移除、某些代謝途徑被精簡，而且與先天免疫反應相識別的布魯氏菌結構也發生了改變。這些論點被以下3個現象證明：(1)布魯氏菌誘導的促炎癥反應明顯低于人蒼白桿菌誘發的促炎癥反應，人蒼白桿菌是已知與布魯氏菌親緣關系最近的條件性病原菌[25]；(2)布魯氏菌不同成員外膜成分差異較小[18]；(3)不同生存狀態下的布魯氏菌關鍵PAMP相關分子結構變化少且不明顯。而與變形桿菌γ和β亞類的病原(如沙門菌或奈瑟菌)相比較，布魯氏菌缺少很多與毒力相關的典型結構，如纖毛、菌毛、莢膜和質粒。同時布魯氏菌的自身結構成分對先天免疫的誘導較弱[26]。體內和體外試驗研究顯示，布魯氏菌繁殖不依賴于TLR4、TLR3、TLR2、TLR5或TRIF接頭蛋白，而且巨噬細胞IL-1β和IL-18受體對布魯氏菌的胞內生存也不是必需的[23]。這些現象說明，布魯氏菌PAMPs(如Br-LPS、脂蛋白、鳥氨酸脂和鞭毛等)缺乏足夠的活性。此外，內膜蛋白BacA缺失可誘導機體產生較強的促炎癥反應[27]，暗示某個PAMP的修飾或改變可影響先天免疫應答反應。由于布魯氏菌的Lipid A比典型的LPS脂肪酸鏈(C12-C16)含有更長的脂肪酸鏈(C28)，所以其與TLR4受體蛋白MD-2的結合力變弱，從而逃避TLR4的識別，大大降低了TLR4誘發的炎癥反應。同時布魯氏菌LPS的O-抗原缺乏自由羥基，因此不能與補體結合，從而抑制了C3a和C5a促炎補體的生成。而且布魯氏菌的鞭毛由于肽段中氨基酸的變化不能激活TLR5，因此也不能誘導促炎反應[28]。

5 布魯氏菌調節適應性免疫

布魯氏菌是一種胞內寄生菌，主要寄生在巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞內，從而影響免疫細胞功能的發揮，逃避宿主免疫系統的攻擊。研究表明：布魯氏菌可以在體內或體外樹突狀細胞中生存繁殖，并抑制樹突狀細胞的成熟和活化。而未成熟的樹突狀細胞不能誘導促炎性細胞因子TNF-α和IL-12的分泌，從而導致TNF-α不能激活吞噬細胞的殺菌活性，IL-12也不能激活Th1免疫反應生成IFN-γ，使布魯氏菌逃避IFN-γ介導的I型免疫反應的殺傷；同時布魯氏菌對樹突狀細胞成熟的抑制也影響了其表面MHC分子的表達，從而抑制了抗原遞呈；已有報道顯示，布魯氏菌LPS可以調節外源性抗原的遞呈作用[29]，這可能與布魯氏菌LPS的非典型結構有關。實際上，Br-LPS可以阻礙巨噬細胞通過MHC-II分子將某些蛋白遞呈給特異性T細胞。同時在B淋巴細胞中，Br-LPS在含有MHC-II分子的溶酶體樣隔室中被富集，而這些隔室具有特殊的抗原“裝載”和加工位點。在巨噬細胞中Br-LPS運輸速率比蛋白質的運輸速率慢，最終Br-LPS分子被運輸到巨噬細胞表面形成由脂筏、MHC-II類分子和Br-LPS等混合物構成的結構簇，而布魯氏菌LPS獨特的O-鏈結構阻礙了其與T淋巴細胞受體的識別[30]。總之，這種現象可以解釋某些病原菌表現出的免疫逃避現象，在一定程度上也可以解釋了慢性布病患者細胞免疫相對抑制的機制。

6 展望

細胞內細菌與宿主之間的關系非常復雜，涉及多種生物學因素和信號途徑。作為一種兼性的胞內細菌，布魯氏菌在與宿主之間不斷發展的相互作用中，通過躲避宿主細胞的殺傷以及逃逸宿主的抗感染免疫，可以在宿主體內長期存活，建立持續性感染，同時其通過對胞內微環境的適應，調控胞內運輸途徑以及細胞凋亡，從而處于一個長期進化的過程。盡管布魯氏菌的持續性感染的機制調控的研究仍在進行中，但仍有許多問題有待進一步解釋。因此進一步明確布魯氏菌參與的不同生物學過程，將為疾病的預防和控制，以及疫苗開發提供新的思路。