植物無融合生殖發生因素解析及其在草地早熟禾育種中的應用前景展望

張金青，牛奎舉，李玉珠，馬暉玲

（甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅蘭州730070）

植物無融合生殖過程不經精卵兩性細胞受精作用而形成種子，其不受雜合性的影響而表現一致［1］。后裔測定和評定簡單，故雜交育種常常需1～2代自交或雜交，雜種生產也不需要特殊的隔離條件、雄性不育系及恢復系，因而無融合生殖的研究對雜種優勢的優異基因型的固定極為有利［2-3］，并且避免了有性生殖的并發癥，如不親和性障礙，以及病毒在典型無性繁殖植物中的轉移［4-5］，同時無融合生殖產生基因型與母本完全一致的種子，在提高育種效率、降低制種成本方面有著巨大潛力［6-7］，在雜交育種界被譽為實現新一次綠色革命的“無性生殖革命”［8-9］。兼性無融合生殖的優勢還在于其使得這種復合體的生物型具有很大的多功能性、適應性和進化能力，因為無融合生殖是一種使目前適應的基因組合倍增的手段，而有性生殖則確保了在進化過程中選擇變異的儲存庫［10］。

植物無融合生殖是一種特殊的無性生殖方式，其避免或者繞過了減數分裂和卵子的受精［11］。Müntzing［12］在1933年報道了草地早熟禾（Poa pratensis）中存在著無融合生殖現象，并發現其主要是無孢子生殖為主的兼性無融合生殖系統。無孢子無融合生殖在功能上由無孢子生殖和孤雌生殖兩個過程組成，其中無孢子生殖產生了沒有經過減數分裂的胚囊，該胚囊是從珠心分化的細胞開始發育的；孤雌生殖則形成了未受精的胚胎［13］。同時，如果存在假受精過程，即未減數的極核與來自雄配子體的精子融合，這些無孢子胚囊將通過孤雌生殖發育成有活力的無融合生殖種子［14］。在這個過程中，后代即種子或者種胚選擇具體哪種方式形成是不一定的，目前隨著同工酶技術、分子標記技術以及分子生物學在無融合生殖研究中的應用，已表明無融合生殖雖然受多種因素的影響，但是其主要是一個由基因控制的遺傳性狀［15-16］。以下就影響植物無融合生殖胚發生發育的主要因素進行綜述，通過分析討論，旨在為包括草地早熟禾在內的植物無融合生殖理論的闡釋與實踐應用提供參考依據。

1 遺傳控制因素

目前，無融合生殖的遺傳學研究比較多，不同物種所得結論不同，表明其遺傳機理具有多樣性，既有單基因控制，又有多基因控制，而且還受環境因素的影響［17］。單基因控制的報道主要在大黍（Panicum maximum）［18］、珊狀臂形草（Brachiaria eruciformis）［19］、摩擦禾（Tripsacum dactyloides）［20］等植物上，且由一對顯性基因控制。多基因控制論主要在蒲公英（Taraxacum mongolicum）中報道，研究發現，蒲公英無融合生殖是由1個以上的基因控制，并報道可能有7個位點與無融合生殖有關［21-22］。隨后有研究認為，狼尾草（Pennisetum alopecuroides）［23］、一年蓬（Erigeron annuus）［24］、蒲公英［25］等植物不完全減數分裂性狀的基因型可以表示為Aaaa或Aaa，無融合生殖由顯性基因控制，隱性基因則代表有性生殖。張斯淇［26］認為這是無融合生殖植物具有性生殖潛能的原因，同時也是兩種兼性無融合生殖植物雜交可以產生純有性生殖后代的原因。草地早熟禾的遺傳機理尚存爭議：Barcaccia等［27-28］以RAPD和AFLP分子標記結合流式細胞儀技術研究了草地早熟禾雜交后代有性生殖和無融合生殖特征，其結果支持單基因控制學說；而Matzk等［29］用流式細胞儀對具有不同生殖方式的32種植物種子樣品進行了分析研究，其結果支持多基因控制學說，即二倍體無孢子無融合生殖和孤雌生殖是不連鎖的。

植物無融合生殖現象早于1841年在Alchornea ilifolia中被發現，隨后在分類、遺傳進化、胚胎發育、形態發生、生理生化和育種等方面都做了大量的研究［30-31］。近年來，隨著現代分子生物學研究技術和手段的廣泛應用，對植物無融合生殖遺傳控制的提出，以及使這一論斷達成業界的共識，注入了強有力的佐證和科學支撐力。

應用RFLP、RAPD、SSR、AFLP以及STS等分子標記和差異顯示等技術，發現了許多與無融合生殖有關的特異片段，這為深入了解植物無融合生殖的遺傳機理提供了有力的科學佐證［31］。Agafonov等［32］采用SDSPAGE技術對草地早熟禾成熟種子內的胚乳貯藏蛋白進行了研究，結果鑒別出了草地早熟禾的無融合生殖特性。Wieners等［33］利用流式細胞計檢測了美國農業部38種草地早熟禾核心種質的生殖方式及DNA含量，結果表明大多數種質表現兼性無融合生殖特性，DNA的變異范圍相當廣，并發現專性有性生殖和專性無融合生殖的種質。同時也檢測到減數胚、孤雌生殖胚及未減數合子胚。Matzk［34］也利用流式細胞儀種子篩選技術，對草地早熟禾專性有性生殖和兼性無融合生殖作為親本雜交和自交產生的分離后代進行了無融合生殖的遺傳特性研究，發現無性生殖種子的形成包括5個主效基因：無孢子生殖起始基因（Ait）、無孢子生殖阻抑基因（APv）、大孢子形成基因（Mdv）、孤雌生殖起始基因（Pit）及孤雌生殖阻抑基因（Ppv），它們表達頻率和外顯率的差異是導致草地早熟禾無融合生殖率不同的原因，且這些基因與無孢子生殖以及孤雌生殖是獨立遺傳的。Albertini等［13］對有性親本和無融合生殖親本雜交獲得的草地早熟禾F1分離群體進行了細胞組織學研究，通過生長素檢測表明，大約一半的F1代植株是孤雌生殖的，其變化范圍為1.44%～92.90%。而且在孤雌生殖植株和兩個非孤雌生殖個體中均檢測到無孢子，于是又應用SCAR分子標記輔助技術對草地早熟禾的兼性無融合生殖相關基因（ParthⅠ和SexⅠ）進行了研究，結果表明兩個不同的遺傳因素控制著草地早熟禾無孢子生殖和孤雌生殖，并且無孢子生殖和孤雌生殖在發育上是不連鎖的。隨后，該課題組又應用cDNA-AFLP技術，分離出無融合生殖與有性生殖的草地早熟禾基因型中花與葉片差異表達的片段，比對這些片段后發現，它們在兩種具有不同生殖方式的基因型中均有表達，其差異在于表達量的不同［11］，這為印證前人提出的無融合生殖是有性生殖過程失調導致的推論提供了直接證據［35-36］，Koltunow等［37］指出這種失調可能是由于基因在有性發育過程中的異時或異位表達；同時分離鑒定得到控制草地早熟禾無融合生殖的兩類基因，體細胞胚胎發生類激素受體基因（SERK），并認為PpSERK基因可能與胚胎發生能力的獲得相關，以及無融合生殖起始基因（APOSTART），其與減數分裂和細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）相關。此外，Porceddu等［38］也應用基于ALFP和SAMPL分子標記的雙向偽測交策略技術，對草地早熟禾無融合生殖和有性生殖基因型進行了連鎖定位的研究，成功獲得了其連鎖基因圖譜。

分子標記在其他植物無融合生殖研究中的應用也有大量的報道，如Catanach等［39］等利用缺失突變作圖，結合AFLP和SCAR分子標記定義了參與Hieracium caespitosum無融合生殖遺傳位點的數量，并探討了這些位點之間的顯性和連鎖關系，結果表明H.caespitosum的無融合生殖受兩個主要位點控制，一個基因位點調控著減數分裂缺失的相關事件（無融合生殖），即loss of apomeiosis（LOA），另一個則控制避免發生受精過程的相關事件（孤雌生殖），即loss of parthenogenesis（LOP）。其中LOA促進了珠心細胞向無孢子起始細胞的分化和發育，而LOP則保證了無孢子胚不經過受精作用也可以成功形成種子，且LOA與LOP位點不連鎖。Koltunow等［40］進一步對綠毛山柳菊（Hieracium pilosella）的LOA和LOP位點的突變體進行分析，結果顯示有性生殖的啟動是刺激胚珠無孢子形成和促進LOA功能所必需的，其使得有性胚囊附近的無孢子起始細胞進行分化，而無孢子生殖胚囊中LOP的功能使不依賴于受精過程的胚和胚乳發育成為可能。這表明在這些兼性無融合生殖物種中，有性生殖是其默認生殖方式。此外，他們認為LOA和LOP可能不編碼對有性繁殖至關重要的因子，但可能在某一時間點上使有性途徑發生變異，進而進行無融合生殖。

組學手段也被大量應用于無融合生殖遺傳機理的研究，相關學者比較了Boechera屬二倍體水平的有性生殖和無融合生殖在4個發育階段胚珠的轉錄表達譜，結果發現無融合生殖胚珠與有性生殖胚珠之間的差異在于特異基因的異時或者異位表達，在早期無融合生殖胚珠發育過程中，大多數發育階段特異基因顯著下調，其中與生殖相關的有110個。相反，在后期大多數發育時期特異基因在無融合生殖胚珠中上調，推測這可能是無融合生殖（六倍體）與有性生殖（三倍體）胚乳中基因劑量增加或孤雌生殖的結果［41］。Schmidt等［16］使用激光輔助顯微切割結合微陣列和RNA-Seq分析，在細胞水平上比較有性生殖和無融合生殖發育轉錄組的差異，發現Boechera屬與其近緣種典型有性生殖植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）生殖方式的差異主要在于幾個不同的調控途徑，包括細胞周期調控、激素信號途徑、表觀遺傳和轉錄調控。Long等［42］采用mRNA-Seq和sRNA-Seq技術對參與柑橘（Citrus reticulate）珠心胚發生的基因及其調控通路進行了研究，通過對多胚和單胚胚珠的轉錄表達譜比較分析，共發現了305個差異表達基因，GO富集分析表明，逆境脅迫響應（特別是氧化脅迫）進程在多胚胚珠中占大多數，同時鑒定出了兩個差異表達的miRNAs，其中miRN23-5p僅在多胚胚珠中表達。國內對柑橘屬（Citrus）植物無融合生殖的研究也有相關報道，Wang等［43］采用極端表型混池測序和局部基因關聯分析的策略，將負責柑橘多胚性的遺傳位點縮小到包含11個候選基因的80 kb區域，其中關聯程度最高的候選基因CitRWP為胚珠特異表達基因，且在多胚材料的表達水平顯著高于單胚材料。Rabiger等［44］采用基因組與轉錄組聯合分析對Hieracium subgenus無融合生殖發生過程中的small RNA通路進行了探索，通過有性生殖型、兼性無融合生殖型和專性無融合生殖型植株子房的轉錄組比較分析發現，與有性生殖型和專性無融合生殖型相比，兼性無融合生殖型的差異表達基因主要在small RNA生物合成和染色質沉默進程中富集。最近在百喜草（Paspalum notatum）［45］、Hieracium praealtum［46］和貫葉連翹（Hypericum perforatum）［47］植物上均報道了應用組學進行無融合生殖機理的研究，這表明組學是研究植物無融合生殖遺傳機理的一種有效手段。此外，Wang［48］介紹了有絲分裂替代減數分裂（MIME）的發展，以及利用Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR/Cas9）基因編輯技術破壞MATRILINEAL（MTL）來實現從卵細胞誘導單倍體植物產生的技術。最新的研究報道，以棉花（Gossypium hirsutum）為材料，針對消減染色體的經典著絲粒組蛋白基因CenH3，在篩選系列相關化學抑制劑及體外誘導效應的基礎上，結合基因干涉操作技術，從體內和體外鑒定了植物兩性花有性生殖過程中伴隨的誘發假雄配子的劑量效應，并驗證了假受精介導的虛擬有性生殖，誘發孤雌單性生殖和種子單倍體的形成［49］。這些報道表明CRISPR/Cas9基因編輯技術以及基因工程干涉染色體消減技術均可用于植物無融合生殖遺傳機理的研究。

2 環境因素

土壤、水分、溫度、光照、大氣等環境因子在方方面面影響著植物的營養生長和生殖生長。無融合生殖作為一種特殊的生殖方式，其發生必然受到環境的影響，尤其是兼性無融合生殖物種的無融合生殖率，易受到外界環境因素如光周期、溫度、無機鹽以及營養水平的影響［50］。Mazzucato等［10］提出草地早熟禾的無融合生殖雖然是遺傳基因控制的，但許多其他因素可能會改變后代中的無融合生殖植株和有性個體之間的比例，即無融合生殖率。同時，他們還認為若要闡明環境對無融合生殖穩定性的影響，重要的是要考慮到造成實驗差異的原因是后代測試環境，還是種子原生產環境，亦或兩者兼而有之。根據相關的研究發現，使用相同的實驗方法，在不同位置和年份進行后代測試時，其種子無融合生殖程度的變化可以忽略不計，僅有兩個兼性無融合生殖材料，當遠離原產地進行評估時，結果是專性有性的：兼性品種蘇格蘭E-702和美國P-29的種子在愛丁堡生產時，均沒有產生無融合生殖的后代［10］。在其他實驗中，母株在不同條件下開花并產生種子時，溫室中開花的植物通常比在田間種植的植物產生更多的有性后代，但是這種差異很小［51-52］。Han［53］報道了赤霉素（gibberellin，GA3）處理，以及光周期、光照強度和施氮量的變化對無融合生殖的程度沒有影響，但溫度變化會增加有性后代的產生。不同的是，Williamson［54］報道，開花期間不同的光照狀態對繁殖方式具有一定的影響。Hovin等［55］也報道了在不同地點生產種子時，生殖方式會發生極小的變化，平均有性行為的增加與短光周期、低緯度以及開花數量的多少有關。

關于兼性無融合生殖物種的無融合生殖率易受環境因子影響的研究，在其他植物上也有報道，且主要集中在光照周期對植物無融合生殖程度的影響方面。例如毛梗雙花草（Dichanthium aristatum）在光照時間大于14 h時，其無融合生殖率平均為59.58%，當光照時間小于14 h時，其無融合生殖率變為90.84%，顯著高于光周期大于14 h時［56］。馬三梅等［57］研究了光照時間對水蔗草（Apluda mutica）無融合生殖程度的影響，結果表明光照時間對花粉育性沒有顯著影響，此外，在自然光照和增加1 h光照時間的條件下，水蔗草無融合生殖率在41%～64%，當減少1 h和2 h及增加2 h光照時，其無融合生殖率為19%～22%，和前者相比，后者顯著下降。對Paspalum cromyorrhizon的研究也發現，12 h光照時無融合生殖率升高，而14 h時無融合生殖率則會下降［58］。然而，Hussey等［59］研究發現，綠毛狼尾草（Pennisetum ciliare）的無融合生殖頻率在8、12和16 h光照時相同，表明綠毛狼尾草的無融合生殖頻率并不隨著光照周期的變化而發生改變。研究結果的多樣性支持了Tothill等［60］提出的光照周期對無融合生殖率的影響是物種特有的反應這一推論，同時他們還認為無融合生殖率隨著光照周期的變化而發生的這種改變可以傳遞給子代，具有可遺傳性，這為相關學者增加兼性無融合生殖物種的無融合生殖頻率，甚至為專性無融合生殖品種的培育提供了另一種新的思路和視角。

另一方面，由于植物對外界環境脅迫的反應會影響基因調控，導致表型變異，從而在環境脅迫和無融合生殖之間建立了聯系［61］。Rodrigo等［62］的研究為這種聯系提供了實例：他們通過統計在干旱脅迫、體外培養和種內雜交3種條件下彎葉畫眉草（Eragrostis curvula）的胚囊基因型，發現不同的脅迫條件可以改變兼性四倍體無融合生殖品種的有性生殖表達，當脅迫停止時，生殖方式又恢復到無融合生殖的原始水平。Gounaris等［63］在鹽脅迫下研究發現，高濃度鹽脅迫條件下生長的無孢子綠毛蒺藜草（Cenchrus ciliaris）植株產生的有性胚囊比例高于對照，他們認為其原因可能是高鹽濃度會引起細胞失水，導致細胞含水量過低，進一步影響細胞的生長、分化和發育。這些結果均表明兼性無融合生殖植物在脅迫條件下更容易轉換為有性生殖，而這種依賴于脅迫的轉換有助于有機體適應脅迫環境，是兼性無融合生殖物種應對環境脅迫的一種策略［61］。

3 倍性因素

目前許多學者把植物的雜種性和多倍性確定為無融合生殖的重要影響因素，他們認為植物的無融合生殖特性與其倍性水平間存在特殊的關系，一般高倍體進行無融合生殖，而低倍體則進行有性生殖［64-66］。如在藥蒲公英（Taraxacum officinale）中，二倍體一般是有性生殖，高倍體則表現無融合生殖特性［67-68］。同樣地，Sarhanová等［69］在研究歐洲群體的懸鉤子屬（Rubus）植物，以及楊鋒等［70］分析平邑甜茶（Malus hupehensis）無融合生殖基因型和雌配子發育模式時均發現二倍體植物全部為有性生殖，三倍體植物則屬于兼性無融合生殖，即可通過無融合生殖方式繁衍后代。唐棣屬（Amelanchier）中，二倍體、三倍體、四倍體物種中分別有2%、75%和97%的種子由無融合生殖產生［71］。Krahulcová等［72］在無融合生殖生物型和有性生殖生物型共存的7個雜交型多倍體的Pilosella種群中，進一步研究了兼性無融合生殖母本對種群多樣性的影響后指出，不僅通過無融合生殖方式產生后代的母本大多為多倍體，而且其后代的倍性水平也是多種多樣的。

Iaffaldano等［73］大范圍收集特別是北美洲的藥蒲公英種質635份材料進行蒲公英倍性和生殖生物學特性的研究，結果顯示二倍體缺乏無融合生殖特性而以有性繁殖產生后代，而較高的倍性水平則可能表現出無融合生殖特性，并且除德國和奧地利的兩個種質外，其余種質均含有多倍體種子，這表明在北美可能缺失普通蒲公英的二倍體有性細胞型。Quarin［58］報道了P.cromyorrhizon不同染色體倍性水平種群的無融合生殖頻率的差異，結果顯示在四倍體水平，其無融合生殖胚囊要遠遠高于二倍體水平，表明無融合生殖的表達可能依賴于基因劑量，且隨著染色體水平的提高無融合生殖的頻率升高。Venkateswarlu等［74］對Coix aquatic自花受精的無融合生殖遺傳進行了研究，結果顯示無論自交或雜交，其后代均會分離出部分無融合后代，他們認為無融合生殖由隱形基因控制，且其后代的隱性性狀可能在二倍體水平上不表達，在四倍體或更高的染色體水平上才能表達。Hojsgaard［75］指出二倍體種群中新多倍體個體的產生通常涉及三倍體的形成，該三倍體的產生是一種基因組休克現象，其特征是基因表達失調、高劑量敏感性、細胞分裂紊亂以及生理和生殖特性發生變化。

黃群策等［76］認為植物多倍性是高等植物細胞內染色體進化的一種顯著特征，當二倍體植物被誘導為同源多倍體之后，相較于二倍體，多倍體的結實率會明顯下降，推測這可能是有性生殖能力變弱的標志，并為某些潛在的無融合生殖基因的表達創造了有利的內部環境。之所以提出這種推論是由于植物有性生殖能力較強時，其無融合生殖基因的表達便會受到限制，反之，當其有性生殖能力變弱時，其無融合生殖基因的表達則會更容易［77-78］。由此可見，植物倍性水平的改變可能會導致其生殖方式的變化，即在二倍體水平進行有性生殖的能力較強，然而倍性增加后，其有性生殖能力會隨之變弱，進而可能表現出無融合生殖的特性，產生無融合生殖后代［79-80］。此外，兼性無融合生殖植物在非生物脅迫后會增加有性生殖的頻率，可能與無融合生殖植物中的多倍體可以減輕DNA的氧化損傷并阻礙減數分裂特異性蛋白Spo11的活化有關［81］。同時，多倍體被認為具有更強的生長勢，可使植物能夠更好地適應極端的氣候條件，然而無融合生殖物種沒有遺傳變異的產生，這對于應對極端環境條件是不利的，因此利用多倍性的優勢來彌補這種缺陷，這可能也是植物在高倍性水平下進行無融合生殖繁殖的原因之一［82-83］。

然而，草地早熟禾生殖方式豐富多樣，既可以進行自交，又可以進行異交，同時其染色體數目也復雜多變，多為非整倍體［84］，在這個遺傳背景下，不同的草地早熟禾材料的無融合生殖率也不盡相同，這是否與染色體倍性甚至染色體數目有關，以及草地早熟禾的無融合生殖是否有基因劑量依賴性、具體表現如何等問題依然是未知的。Porceddu等［38］也報道，草地早熟禾的花粉識別系統與其無融合生殖特性相結合，使其具有強大的雜交能力和保留外來基因組的能力，同時也導致了高倍數水平（x=7，2n=28～147）和異常染色體數（2n=36～123）基因型的出現，這進一步使得遺傳分析復雜化，故目前對草地早熟禾遺傳背景的了解還不夠透徹。因此，有關草地早熟禾的無融合生殖和倍性之間的相關性還未見文獻報道。Zhao等［85］結合熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術，從Cot-1 DNA文庫中分離到4個新的草地早熟禾染色體標記，并表明這些染色體標記是準確評估染色體數目、基因組和系統發育分析以及研究草地早熟禾無融合生殖的有力工具。這為揭示草地早熟禾無融合生殖特性與其倍性水平間的特殊關系提供了新的研究思路，劉燕等［86］已統計出了采集于甘肅本土的8個野生草地早熟禾種質材料的無融合生殖率，后期擬將應用這些染色體標記對其無融合生殖率和染色體數目之間的相關性做進一步的研究，以明晰草地早熟禾無融合生殖特性與其倍性水平間的關系。

4 激素水平和礦物質營養

除植物的雜種性和多倍性被確定為影響無融合生殖的重要因素外，生理因素和內源激素也被認為是產生無融合生殖的直接原因［87］。然而，有關這個方面所做的研究較少，僅殷朝珍［88］在2006年測定了專性無融合生殖、專性有性生殖和兼性無融合生殖草地早熟禾小穗中的內源激素含量并分析了其對草地早熟禾無融合生殖的調控作用，結果表明胚珠或胚囊細胞內的細胞分裂素含量高，且當脫落酸（abscisic acid，ABA）含量較低時，或者具有較高的玉米素核苷（trans-zeatin-riboside，ZR）/ABA值時，可能會促進植物無融合生殖的發育。劉燕等［89］研究了甘肅野生草地早熟禾內源激素含量的變化與無融合生殖率的關系，結果表明無融合生殖率與玉米素（zeatin，ZT）、ZR、ABA、（ZT+ZR）/吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）和（ZT+ZR）/ABA呈顯著正相關，與GA3、IAA/ABA和GA3/ABA呈顯著負相關，與IAA無顯著相關性。因此，高的ZT、ZR和低的ABA含量、高的（ZT+ZR）/IAA和（ZT+ZR）/ABA比值更可能促進胚珠向無融合生殖途徑發育，高的GA3含量可能促進胚珠向有性生殖途徑發育。盡管這方面的研究報道較少，但是可以在無融合生殖與激素之間建立一種間接聯系，因為基因的表達會受到激素的調控，而植物無融合生殖又是受基因控制的遺傳性狀，因此激素必然在植物無融合生殖基因的表達中具有重要的調控作用［90］。CycD基因的表達直接決定著細胞能否進入分裂周期，而細胞分裂素可以引導CycD的表達進而促進細胞分裂。因此，可以推測細胞分裂素可能會對無孢子起始細胞不進行減數分裂過程起調控作用［91-92］。導入BBM基因的白菜（Brassica pekinensis）幼苗表現出產生體細胞胚以及細胞分裂素過量的特征［93］，這表明細胞分裂素可能對不依賴于受精作用的體細胞胚的誘導有重要的作用。此外，Tang等［94］通過對懸鈴葉苧麻（Boehmeria Tricuspis）二倍體的有性繁殖和三倍體的無融合生殖個體進行比較轉錄組分析，結果表明植物激素信號參與了懸鈴葉苧麻無融合生殖的發育以及多倍化反應。Tucker等［95］研究了Hieracium的胚珠發育過程中生長素極性運輸受到抑制時，對無融合生殖和有性生殖的影響，結果表明生長素極性運輸影響著胚珠的發育、無融合生殖的啟動以及胚囊發育的進程。國內的研究多報道了適宜濃度的外源激素對植物無融合生殖的誘導，且不同植物所用的激素類型、施加方式、施加濃度、施加時間、施加部位以及施加次數均不相同［96-98］，這些研究均為揭示激素信號對植物種胚形成的調控作用提供了間接或直接依據。

礦物質因素對無融合生殖的影響在國內外都鮮見報道，尤其對植物無融合生殖產生影響的內在機制依然未知。僅張鵬飛等［99］在2006年曾報道過無融合生殖核桃（Juglans regia）果實中礦物質營養含量的變化，結果顯示Ca、Mg、Cu、Mn、Zn和K這6種礦質元素在無融合生殖果實中的含量在年周期中都呈下降趨勢，而下降的時期略有不同，且無融合生殖果實比有性生殖果實下降的要多。同時，無融合生殖果實中K、Ca、Mg、Fe、Mn諸元素含量均低于有性生殖果實。他們認為這可能是因為無融合生殖果實比有性生殖果實礦質營養水平低，進而導致其敗育的原因。目前在植物無融合生殖的激素和礦物質營養調控作用方面的研究較少，為能系統地闡明影響植物無融合生殖的原因，應從激素水平和礦物質營養層面入手做進一步的探究。

5 無孢子起始細胞出現的時間和位置

草地早熟禾主要的無融合生殖方式為兼性無孢子生殖，其是珠心細胞特化為無孢子起始細胞后經過有絲分裂形成成熟胚囊，從而繞過了減數分裂和精卵細胞的融合［100］。Carman［101］指出無融合生殖的胚囊由大孢子母細胞的相鄰體細胞（珠心細胞）的提前成熟而形成，并且發生在多倍體中的無融合生殖，是由近整套的重復基因異步表達后競爭的結果。Koltunow等［102］通過對Hieracium的組織學研究發現，遺傳因素可以改變無融合生殖的起始時間、空間位置和發育進程，表明受遺傳控制的無孢子起始細胞出現的時間與位置會影響兼性無融合生殖植物種胚的形成途徑。

溫沁山等［103］通過對非洲狼尾草（Pennisetum squamulatum）無融合生殖胚胎學研究發現，狼尾草無孢子生殖胚囊中，當多個珠心細胞同時特化時，只有最靠近珠孔端的能成功形成成熟胚囊，其余的珠心細胞均會解體。推測這一現象可能與無孢子生殖胚的位置有關，靠近珠孔端的胚囊較易吸收來自胚珠的營養，故有利于繼續發育，與之相反的是，遠離珠孔端的胚囊可能難以得到充足的營養而不能正常發育。除此之外，國內外在這方面的研究尚未見報道，因此胚珠內存在營養梯度的這一推論是否正確，依然有待商榷。雖然目前關于無孢子起始細胞出現的時空對兼性無孢子生殖物種種胚發生發育具有影響的研究寥寥無幾，但相關的報道均為表明無孢子起始細胞的時空是影響無融合生殖胚的重要因素之一提供了間接或直接依據。然而，草地早熟禾中卻未見相關研究的報道，故為闡明影響草地早熟禾種胚發生發育的因素，應進一步研究并分析無孢子起始細胞出現的時間和位置與草地早熟禾無融合生殖胚的相關性。

自然界中，大多數多倍體植物繁衍后代的方式依然是有性生殖，極少數植物在高倍體水平進行無融合生殖，低倍體進行有性生殖，表明倍性是影響無融合生殖的重要因素之一，但不是無融合生殖產生的直接原因［90］；同時通過對影響無融合生殖的每一因素的深入分析，發現無融合生殖的發生不是任何一種現象所引起，而是多種因素共同作用的結果，這表明影響植物無融合生殖的因素具有多樣性［104］。遺傳控制因素從本原上決定了無融合生殖的發生趨勢［105］，而環境、倍性、激素水平和礦物質營養以及無孢子起始細胞出現的時間和位置都對無融合生殖的發生發育產生了重要的影響。

6 草地早熟禾無融合生殖優勢分析及其在種質創新中的應用前景展望

6.1 草地早熟禾無融合生殖特性及現存問題

草地早熟禾是禾本科早熟禾屬（Poa）植物［106］，主要分布在寒帶和北溫帶冷涼濕潤地區［107-108］，是草原與草甸植被組成中的重要成分［109］。草地早熟禾不僅由于營養豐富、適口性好、再生能力強，是很多天然草地中的優良牧草之一［110］，而且也因其質地平滑、綠期長、坪質優美以及耐修剪等優點而作為寶貴的草坪植物種質資源被廣泛應用于草坪建植［111］，同時也可用于穩定侵蝕土壤以及改善土壤結構和肥力［112］。此外，草地早熟禾具有豐富多樣的生殖系統，主要是無融合生殖和有性雜交或者自交二者共同存在的兼性無融合生殖體系［27，33］，其無融合生殖率因品種和來源的不同而存在較大差異，變化范圍在0～100%［34］，因此草地早熟禾可以作為研究植物無融合生殖及其遺傳的“模式”物種［113-114］。草地早熟禾復雜的生殖系統也決定了其具有顯著的進化和適應能力，這是由于兼性無融合生殖植株的后代既可來自無融合生殖，也可以起源于有性生殖，從適應性的觀點來看，無融合生殖在世代之間固定和繁殖成功的基因型，是使目前適應的基因組合倍增的一種手段，而有性生殖則確保了在進化過程中選擇變異的儲存庫［10］。

目前，國外利用無融合生殖已育成了一系列優良的草地早熟禾草種。如美國通過種內雜交育出了34個草地早熟禾栽培種［115］。德國也成功育成了可供牧場和草坪使用，品系表現整齊一致的種內和種間雜種［116］。然而，國內未見利用無融合生殖方式培育草地早熟禾優良草種的研究報道。我國對草地早熟禾等植物無融合生殖現象的研究大多局限在胚胎發生學上［117-118］，且新型生物技術的應用欠缺，故對無融合生殖遺傳機制依然缺乏系統和深入的認識。同時由于草地早熟禾子房極小，且有穎片及稃片的包被，采用石蠟切片技術對草地早熟禾的胚囊及無融合生殖特性進行研究尚且存在一定的困難，故近二十多年來我國在草地早熟禾無融合生殖特性方面的報道甚少。僅蘇群達［119］報道過草地早熟禾‘納蘇’的無融合生殖方式以及類型，直到2014年，田晨霞等［113，120］對草地早熟禾‘巴潤’的胚發育特性進行了研究報道，對457個帶有稃片的子房進行切片，觀察到其生殖過程中的5種胚囊類型，其具備有性生殖和無融合生殖兩種生殖方式。草地早熟禾有性生殖胚囊較少見，僅占1.44%。無孢子生殖為其生殖方式的主要形式，所占比例為49.67%。在草地早熟禾胚珠合點端常可觀察到1～2個特化珠心細胞的形成及其萌動的發育狀態，其之后的發育及成熟成為草地早熟禾胚囊發育的主導部分。在其無融合生殖過程中，亦存在少量的孤雌生殖和無配子生殖現象。前者所占比例為10.72%、助細胞胚囊和反足細胞胚囊分別為4.82%和7.66%。

截至目前，相關學者雖然認識到無融合生殖受多位點多基因控制，但由于其性狀的表達受不同遺傳背景的影響，至今未見將調控無融合生殖的主要基因分離或克隆，并導入相關植物應用于實踐的成功例子。在無融合生殖方式的應用上，雖然在重要農作物上通過傳統的雜交-回交技術從近緣野生種向栽培種引入無融合性狀，但對其遺傳生理機制的了解甚少，所獲的雜種植株無融合性狀依然不穩定［90］。草地早熟禾的生殖體系是兼性無融合生殖，種胚的形成既可以通過有性生殖發生，也可以進行無孢子生殖，故探討和分析包括草地早熟禾在內的植物無融合生殖胚發生發育的主要影響因素對于系統地理解草地早熟禾無融合生殖的發生機理具有重要意義，同時也為我國通過無融合生殖途徑培育草地早熟禾優良新品種的應用實踐提供依據。

6.2 草地早熟禾無融合生殖在育種中的應用前景展望

無融合生殖特性在雜交制種應用方面具有極大的潛力，遺傳機制及其調控機理研究取得突破則可能會帶來作物生產方式的又一次“革命”。因此，應用無融合生殖進行育種，是近年來育種學家所關注的一個新領域。本課題組多年來在草地早熟禾無融合生殖特性的研究中，積累了一定的經驗，取得了一些研究成果，尤其是在其研究進程中，進行不斷探索和深入思考，對無融合生殖方式在草地早熟禾分子生物育種中的應用前景，有著以下的推測和展望。

1）草地早熟禾是無融合生殖率較高的物種，其在甘肅的分布十分豐富［121］，充分利用甘肅省優良野生草地早熟禾種質資源，深入了解其無融合生殖方式發生的遺傳物質結構，遺傳信息的傳遞方式以及功能基因的表達水平，闡明無融合生殖的遺傳機理，以期發掘和培育本土草地早熟禾優良新品種，并通過無融合生殖方式固定雜種優勢，從中找到獲取和固定草地早熟禾雜種植株優良遺傳性狀的理想途徑。

2）草地早熟禾染色體行為研究。結合熒光原位雜交技術，鑒定并分離出新的草地早熟禾染色體標記，對其染色體數目、基因組和系統發育進行研究，以期掌握其復雜的遺傳背景。

3）應用激光掃描共聚焦顯微這一新技術對草地早熟禾子房中特化的珠心細胞，即無孢子起始細胞出現的時間和位置進行觀察分析和統計，進一步確定無孢子起始細胞出現的時空對其無融合生殖種胚形成的影響。

4）利用比較轉錄組學分析低、高頻無融合生殖率的草地早熟禾品種，篩選并克隆無融合生殖相關候選基因，將其轉入無融合生殖率低的草地早熟禾材料，以提高其無融合生殖率，或者以轉基因手段提高其他植物無融合生殖的能力，為改變其他物種的生殖方式奠定基礎。

5）通過多個組學和局部基因關聯分析，找到控制無融合生殖方式發生的調節因子，人工合成調節劑，通過外源施用調節劑提高植株的無融合生殖率，獲得具有廣范圍種譜的、雜種優勢的、且穩定遺傳的優質種源。