基于網絡藥理學探討植物提取物在飼料添加劑領域的研究進展

丁浩軒 趙 陽 馮 杰

(浙江大學飼料科學研究所，浙江省動物營養重點實驗室，杭州310058)

飼用抗生素的應用促進了畜牧行業的高速發展，但也引發了藥物殘留、抗性篩選、環境污染等一系列問題。針對抗生素濫用的現狀，農業農村部194號公告指出自2020年7月1日起，飼料生產企業停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。飼料中促生長類藥物的禁用，使得中草藥、益生菌、酸化劑等替代產品迎來了發展機遇。中草藥植物提取物中含有豐富的天然活性成分，并能夠促進動物生長，其常在畜牧業中作為替代抗生素產品[1]。然而，因植物提取物活性成分組成復雜、靶點位置繁多而缺乏藥效作用機制的相關研究。網絡藥理學融合系統生物學、計算生物學、生物信息學、多組學聯用等多學科的理念，構建“表型-基因-靶點-藥物”生物網絡，能夠為揭示藥物作用機制提供大數據工具[2]。目前，植物提取物在畜禽健康養殖中的應用往往停留在表型層次，缺乏基因表達和信號通路層面的相關認識。本文基于網絡藥理學對植物提取物在畜禽飼料添加劑領域中的研究現狀進行總結，旨在為植物提取物在畜禽體內作用機制解析提供系統藥理學工具。

1 網絡藥理學研究現狀

1.1 網絡藥理學的常用數據庫

網絡藥理學可以基于多種數據庫進行數據挖掘、靶點篩選、功能分析和構建網絡，高速發展的組學測序技術為數據庫的更新換代注入了強勁的動力。數據庫是網絡藥理學高速發展的基礎，目前常用的數據庫簡介如下：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)是從中草藥中挖掘天然產物的系統藥理數據庫，其可以用于中草藥中化合物組成確定和作用靶標篩選[3]；獲得蛋白靶點后可以進行基因篩選的全球蛋白質資源(universal protein resource，UniProt)數據庫[4]；體現化合物和蛋白質互作關系的STITCH/STRING數據庫[5-6]；注釋、可視化和綜合發現數據庫(the database for annotation, visualization and integrated discovery，DAVID)可以通過基因本體(gene ontology，GO)富集和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路分析進行基因注釋及聚類分析[7]。網絡藥理學涉及到的相關數據庫中信息仍在不斷擴增，豐富的數據庫為解析植物提取物的作用機制提供了真實可靠的云計算。此外，實驗室中獲得的組學數據也可以上傳數據庫平臺共享，這進一步豐富了數據庫的功能。這些數據庫的建立標志著網絡藥理學逐步走向共享化、高速化、精準化，網絡藥理學相關數據庫將會成為植物提取物研究領域科研人員必不可少的工具。

1.2 網絡藥理學的研究路線

植物提取物作為植物的次生代謝產物往往來源于傳統的中藥材，并分為多酚類、多糖類、多肽類等種類[8-9]。單一植物提取物的分析技術路線通常是根據化合物靶標數據庫獲得靶點信息，通過基因注釋后整合靶標和疾病關系，構建“化合物-靶點-通路-疾病”生物網絡。在進行網絡藥理學分析后，我們可以對關鍵靶點進行篩選，并進行試驗性的驗證。網絡藥理學為植物提取物研究人員提供了可視化的角度，這被認為是大數據時代下新一代研究植物提取物相關領域的新模式[10]。此外，單一種類的植物提取物并未充分發揮天然產物中活性成分的組合優勢。中草藥的配伍是中醫方劑“君臣佐使”原則的體現，而中草藥中的不同植物提取物也存在互作關系[2,10]。中草藥中含有的多種植物提取物也遵循辨證論治，更應從整體的角度考慮其功效。網絡藥理學構建“多成分-多靶點-多通路”的系統論思想與中草藥的混沌營養特點不謀而合[11]。因此，藥物網絡的構建能夠解析植物提取物功能的復雜機制，這將會進一步推動對植物提取物的認識。

1.3 網絡藥理學的核心思想

網絡藥理學的核心思想是構建生物網絡。隨著科技水平的提高，我們對天然產物中獲得植物提取物有了更為深刻的認識。然而，我們僅了解植物提取物的組成還遠遠不足以認清化合物與機體之間的復雜關系。基因敲除是認識化合物和機體代謝通路關系的有效措施之一，但阻斷信號通路會引起遺傳補償效應，促進其他通路反饋性調節[12]。生物體如同黑匣子，植物提取物的刺激在體內形成了復雜交錯的信號通路，單一信號通路并不能揭示機體的混沌變化。生物網絡借助了大數據時代下的數據庫，將機體中的互作關系抽象成連線，各個組分轉化為節點，由點和線交織而成的網絡構成了機體的復雜代謝進程[13]。在獲得“化合物-靶點-通路-疾病”生物網絡后，通過網絡結構的拓撲學分析獲得了關鍵靶點，這將會加速植物提取物作用機制的研究。因此，生物網絡的構建實現了植物提取物作用靶點的聚類，有助于分子作用機制可視化。

2 網絡藥理學在飼料添加劑領域的應用

2.1 植物提取物在飼料添加劑領域的研究現狀

植物提取物含有的天然生物活性成分具有代替飼用促生長抗生素的潛力[14]。生物活性成分主要包括多酚類、多糖類、多肽類等營養物質[15]。我國是天然產物品種最豐富的國家，得天獨厚的資源優勢促進了植物提取物在飼料添加劑領域的研究與應用[1]。國內外科研人員對植物提取物作為飼料添加劑的應用有許多報道，主要集中在生長促進效果、調控脂質合成、增強疾病抗性、緩解氧化應激、干預腸道菌群、提高消化酶活性等方面。Ding等[9]研究表明，杜仲提取物對斷奶仔豬有顯著的生長促進效果，且優于飼用抗生素。Mahmoud等[16]研究發現，大蒜提取物通過抑制參與膽固醇和脂質合成的關鍵酶(如蘋果酸酶)，對肉雞、蛋雞和鵪鶉等家禽表現出降低膽固醇的作用。Kim等[17]報道了大蒜中的多酚物質大蒜素作用于艾美球蟲的細胞質膜，改變質膜陽離子滲透性，導致艾美球蟲死亡，進而增強了家禽的球蟲病抗性。Cangiano等[18]研究發現，飼糧中補充橄欖油生物活性提取物成功減輕了斷奶母牛持續免疫激活的負面影響。Su等[19]揭示了補充玉屏風多糖后凡納濱對蝦腸道微生物多樣性和豐富度下降以及與短鏈脂肪酸代謝相關功能基因表達增加的現象。Wang等[20]研究證明，斷奶仔豬飼糧中補充適宜甜菜堿有助于豬腸道中淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性的提升。盡管國內外對植物提取物在畜禽養殖中進行了不同形式的實踐獲得了一系列良好應用效果，但是植物提取物對表型干預的分子機制研究仍然十分匱乏。飼用植物提取物相關研究可以將網絡藥理學作為工具，借鑒生物網絡的構建模式，尋找到活性成分作用靶點，助推植物提取物的分子機制研究。

2.2 基于網絡藥理學解析植物提取物的作用機制

2.2.1 單個活性成分機制研究

植物提取物中豐富的活性天然產物成分是潛在藥物挖掘的最佳來源。丹酚酸A是從丹參中提取的重要活性成分之一，并在多種心血管損傷中表現出了良好的保護效果[21]。Chen等[22]通過計算反向對接和化合物-蛋白質相互作用分析預測潛在目標，并基于GO和KEGG通路分析構建了丹酚酸A的生物網絡，揭示了13個潛在相互作用的靶標，獲得了靶點相關的44條44種KEGG信號通路富集信息。綠原酸是一種具有抗氧化、抗炎、抗病毒的多酚酯，廣泛來源于杜仲、金銀花等草本植物[9, 23]。Mei等[23]利用基于配體的反向篩選和復合靶點網絡預測了綠原酸的可能靶點，表明單胺氧化酶B是綠原酸的主要靶點，并通過體外試驗證實預測，進一步通過分子對接和分子動力學模擬揭示了綠原酸與單胺氧化酶B的詳細相互作用機理。浙貝母中的主要生物活性物質是貝母素甲，貝母素甲常用于鎮咳化痰和鎮靜舒痛[24]。Zhang等[25]揭示了“藥物-靶標-通路”的生物網絡，確定了23個與咳嗽相關的潛在靶點，提示絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)1、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)1和蛋白激酶Cβ(protein kinase C beta，PPKCB)可能是治療咳嗽的重要靶點。由此可見，在有完備數據庫的情況下，網絡藥理學能夠成為單個活性成分機制解析的便捷工具。

2.2.2 單株植物多個活性成分機制研究

單株植物中獲得的天然產物往往不止1種，復雜的化合物組成類似中藥復方。網絡藥理學的“多成分-多靶點-多通路”的構建思路能夠契合植物提取物的多組分配伍。Nie等[26]通過網絡藥理學研究發現，紅蕓豆外皮提取物會調節細胞周期，并在細胞試驗中驗證了猜測。Jiang等[27]在分子試驗基礎上揭示了茉莉花提取物對破骨細胞的分化作用，并使用網絡藥理學表征茉莉花提取物通過核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、MAPK和AKT介導的機制抑制破骨細胞分化。Wang等[28]通過小鼠炎癥模型測試了丁香葉提取物的體內抗炎功效，并基于丁香葉提取物主要活性成分構建生物網絡，NF-κB1、轉錄因子p65(transcription factor p65，RELA)、AKT1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亞單位γ異構體(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma isoform，PIK3CG)被確定為關鍵靶標，MAPK、NF-κB、T細胞受體(T cell receptor，TCR)和Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號通路可能參與了丁香葉提取物的抗炎作用。Zhang等[29]構建了雷公藤提取物與克羅恩病的生物網絡，揭示了主要靶基因血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、MAPK8和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3，CASP3)通過癌癥通路、TNF通路發揮免疫調節的作用。簡而言之，多個活性成分作用機制解析更能體現網絡藥理學的高效便捷，并進一步可以通過體內和體外試驗驗證網絡中互作關系的準確性。

2.2.3 復方植物提取物機制研究

復方中草藥根據藥物特性配伍組方，使得多種中草藥材中活性成分與多個靶點發生了交互作用。飼用植物提取物中也存在很多復方組合的產品。如呂明其等[30]發現飼糧中添加2種植物提取物(主效成分大蒜素、檸檬酸等)能有效改善斷奶仔豬的免疫功能。此外，據報道仔豬飼糧中補充0.1%復方植物提取物可以提高豬的生長性能和抗氧化能力，并有代替飼用抗生素使用的潛力[31]。盡管我們認識到了復方植物提取物能夠發揮較好的生長促進效果，但我們對其發揮功能的機制仍然缺乏系統認識。網絡藥理學基于生物網絡的視角能夠基本闡明復方植物提取物的作用機制。Xu等[32]通過網絡藥理學分析表明，葛根、黃琴、黃蓮和甘草組成的復方提取物可以調節82種糖尿病相關的關鍵蛋白質，并在糖尿病小鼠模型中驗證雌激素受體α的重要性。Hu等[33]揭示了小柴胡湯通過AKT1、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、Jun原癌基因(Jun proto-oncogene，JUN)、MAPK8和信號轉導子與轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)關鍵靶點在非酒精性脂肪肝治療中發揮關鍵作用，且免疫調節、代謝調節和緩解應激是小柴胡湯功能的核心。Fan等[34]研究了疏肝健脾方主要是通過IL-6、腫瘤蛋白53(tumor protein 53，P53)、前列腺素-內過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)等關鍵靶標預防肝臟纖維化。復方植物提取物通過網絡藥理學的方式揭示了活性成分配伍規律[35]，并有助于探索復方植物提取物在畜禽體內的作用機制。

3 網絡藥理學在飼料添加劑領域面臨的挑戰

雖然網絡藥理學逐步作為植物提取物相關研究不可或缺的大數據工具，但是其在飼料添加劑領域應用中仍然存在一些值得我們關注的問題。1)數據庫的建立是網絡藥理學研究的基礎，但畜禽生長相關的數據庫仍然匱乏。例如，胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、黑皮質素受體-4(melanocortin 4 receptor，MC4R)和脂肪酸結合蛋白3(fatty acid-binding protein 3，FABP3)等基因是豬生長性能和繁殖性狀有關的重要基因[36-37]，但目前網絡藥理學的關注點主要在人類疾病相關研究，仍缺乏動物營養相關的數據庫。在畜牧領域中，我們可以在TCMSP等系統藥理學數據庫的基礎上，納入體現動物營養相關的互作基因，進而豐富原有數據庫內的數據。2)飼用植物提取物的生產廠家執行標準不同，同類產品中的主效成分可能波動范圍較大。丁浩軒等[38]報道中采用的杜仲提取物功能成分為多糖(≥20.00%)、黃酮類(≥8.00%)、綠原酸(≥5.00%)。李晨燕等[39]使用的杜仲提取物功能成分為綠原酸(≥3.5%)和黃酮類化合物(≥20%)。企業標準引起的產品主效成分差異會直接影響到網絡藥理學的網絡構建，且動物生長促進效果的差異也難以判別主要原因。3)植物提取物中的有效成分并非在胃腸道中以本體形式直接發揮功效，吸收進入機體后的生物活性成分會經過肝臟甲基化、硫酸化等修飾途徑轉化為共軛產物才能進入循環系統[40]。基于模擬計算的藥效功能團需要關注修飾后的構象，并輔以細胞試驗進行關鍵靶基因的驗證。4)網絡藥理學的數據庫仍在不斷更新換代，數據庫的信息往往來源已發表文獻，這可能會存在熱點研究文獻的信息偏移[11]。因此，網絡藥理學在納入最新文獻的基礎上，也需要結合關鍵靶點的驗證性試驗。5)網絡藥理學中涉及到的計算生物學、生物信息學、多組學聯用等學科涉及到復雜的R語言，對于傳統的營養學研究學者而言，數據分析較為困難，目前急于開發出較為簡單的分析操作軟件。

4 小結與展望

植物提取物在畜禽生產中已經有廣泛的應用，并在抗生素禁令下迎來了高速發展的黃金時期。網絡藥理學可以基于多種數據庫進行數據挖掘、靶點篩選、功能分析和構建網絡，高速發展的組學測序技術為數據庫的更新換代注入了強勁的動力。在信息化時代，網絡藥理學為植物提取物研究提供了一個系統的生物信息學工具，在獲得“多成分-多靶點-多通路”的生物網絡基礎上，通過網絡結構的拓撲學分析獲得了關鍵靶點，這將會加速植物提取物作用機制的研究。網絡藥理學為植物提取物在畜牧業中應用提供了大數據工具，并基于動物精準營養需要構建生物網絡，闡釋植物提取物的作用機制與信號通路，這無疑會助推畜牧業為人民群眾提供高效優質和綠色環保的畜產品。盡管網絡藥理學在實際應用中仍然存在一些缺陷，但是其系統研究思路仍具有重要借鑒意義。