奶牛肝臟功能及其免疫調節作用的研究進展

牛 慧 童津津 熊本海 蔣林樹*

(1.北京農學院動物科學技術學院，奶牛營養學北京市重點實驗室，北京102206；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193)

肝臟是奶牛重要的營養代謝、解毒以及免疫器官。肝臟在奶牛乳腺組織合成乳過程中提供了主要的糖異生作用產物，同時在脂質代謝和氨基酸代謝中也發揮著核心作用[1]。在奶牛代謝過程中，來自于消化道中的營養物質以及微生物抗原物質等經門靜脈到達肝臟，還有一部分抗原物質隨富含氧的血液經肝動脈到達肝臟，激活肝臟的免疫防御機制。目前已發現多種疾病與奶牛的肝臟免疫相關。Byrne等[2]研究發現，肝吸蟲感染奶牛肝臟后，對奶牛免疫應答以及奶牛分枝桿菌結核病的診斷存在一定的干擾作用。常廣軍等[3]研究表明，飼喂高精料飼糧導致的奶牛亞急性瘤胃酸中毒(SARA)與肝臟免疫基因啟動子區域DNA甲基化率降低、肝臟免疫相關基因表達增強有關。Trevisi等[4]指出，可以通過監測泌乳早期肝臟炎癥反應的生物標志物，如C反應蛋白(CRP)、銅藍蛋白(CP)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、結合珠蛋白(Hp)來監測奶牛的健康狀況，以維持奶牛較高的生產性能。

肝臟中的枯否氏細胞(Kupffer cell，KC)、肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)、樹突狀細胞(dendritic cell,DC)、肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)等構成了肝臟的非實質部分。肝細胞是肝臟實質部分的基本組成單位，其主要通過表達并分泌大量的天然免疫蛋白進入血液來抵御微生物的入侵[5]。這些蛋白質包括具有殺菌作用的補體蛋白(complement proteins，CP)，增強吞噬作用的免疫調理素(immune opsonin，IO)，調節脂多糖(LPS)信號的可溶性因子，以及激活天然免疫的凝血因子纖維蛋白原(fibrinogen，FG)。肝臟非實質細胞連同肝細胞參與復雜的局部和全身免疫功能。來自肝動脈和門靜脈的大量血液經過肝臟濾過之后，廢棄物以及毒害物質由膽汁排到腸道，隨糞便排出體外。此外，肝臟在肝-腦軸中占有關鍵位置，這一神經軸主要通過維持奶牛各項生理功能正常運行，特別是調控奶牛肝臟合成葡萄糖、維持血糖穩態來發揮作用。

1 肝臟中的免疫相關細胞

1.1 枯否氏細胞

枯否氏細胞是一種巨噬細胞，存在于肝血竇內，其占天然巨噬細胞總數的80%～90%[6]，是抵御來自門靜脈血液中免疫反應性物質的第1道防線。枯否氏細胞通過模式識別受體如Toll樣受體(TLRs)、RIG-Ⅰ樣受體(RLRs)、NOD樣受體(NLRs)和C型凝集素受體(CLRs)，識別病原相關分子模式和損傷相關分子模式[7]。當枯否氏細胞被激活后釋放各種細胞因子、趨化因子以及可溶性生物介質。Toll樣受體4(TRL4)在內毒素的識別以及信號轉導中起著重要的作用。在LPS型奶牛乳腺炎中，LPS誘導TLR4激活后，通過髓系分化因子88(MyD88)依賴和非依賴途徑，誘導核因子-κB(NF-κB)與促炎基因的結合，導致促炎細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的產生[8]。在奶牛處于SARA狀態時，NOD樣受體1(NLR1)被肽聚糖的降解產物二氨基庚二酸(DAP)激活，使同型的半胱天冬酶(Caspase)活化與募集結構域(CARD)反應，通過招募下游的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體相互作用蛋白2(RIP2)，與NF-κB抑制蛋白(IκB)激酶(IKK)亞基結合，促進IκB的磷酸化，最終致使炎性細胞因子過量表達[9]。RLRs能夠識別單鏈RNA、雙鏈RNA病毒。最近已經有研究報道，口蹄疫病毒、肌病毒、牛痘病毒能夠引起奶牛乳腺炎[10-12]。被激活的RLRs及其CARD，通過與線粒體內的抗病毒信號蛋白相互作用，激活干擾素調節因子3(IRF3)和NF-κB，啟動信號轉導途徑[13]。

1.2 肝竇內皮細胞

肝竇內皮細胞是肝臟中數量最多的非實質細胞，在清除大分子物質以及抗原呈遞方面起著重要的作用。清道夫受體是肝竇內皮細胞表達的典型識別受體，由于肝竇內皮細胞上面有很多窗孔，基底膜物質少，大分子物質不能通過，故將這些物質輸送至肝細胞進行代謝[14]。此外，肝竇內皮細胞還能吞噬抗原呈遞給T細胞，誘導免疫耐受[14]。肝竇內皮細胞對大多數肝病的發生發展具有重要的調控作用。從妊娠晚期過渡到哺乳早期這一段時間內，很多高產奶牛由于被持續飼喂高精料型飼糧而造成過度肥胖，奶牛產后食欲不振，為了維持正常泌乳，便動用機體脂肪和肌肉中的能量。其中脂肪在各種酶的作用下轉化為游離脂肪酸，通過血液到達包括肝臟在內的全身器官，并在肝細胞中以甘油三酯的形式積聚，形成脂肪肝。相似的是，在奶牛身上觀察到的脂肪肝與人類的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)有許多共同之處[15]。Mcmahan等[16]關于NAFLD的研究表明，肝竇內皮細胞主要通過調控血液中脂質和脂蛋白的轉運，參與脂肪肝的病理調控過程。Kuhla等[17]利用雙向凝膠電泳(2-DE)和飛行時間質譜(MALDI-TOF)技術比較了正常飼喂奶牛與限飼奶牛的肝臟組織，蛋白質組學結果表明，催化膽固醇和磷脂在膜之間交換的甾醇載體蛋白2在限飼奶牛中含量更高，表明脂質運輸增加，這強調了肝竇內皮細胞在奶牛脂肪肝形成過程中的重要調控作用。

1.3 樹突狀細胞

樹突狀細胞主要位于肝臟門脈基質、膽管及肝竇附近，是一種專業的抗原提呈細胞[18]。樹突狀細胞不僅能夠介導肝臟免疫系統的激活，其在炎癥反應過程中也起著關鍵作用。Barfoot等[19]研究表明，從反芻動物綿羊的肝臟中分離出來的樹突狀細胞表面有豐富的免疫球蛋白和Ⅱ類組織相容性抗原，后者由主要組織相容復合物(MHC)編碼，其在動物體免疫機能中發揮著重要作用。葉素成[20]采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術探究了奶牛MHC與奶牛乳中體細胞數(SCC)的關系，結果表明，MHC的DRB3基因位點存在多態性，其中Hae ⅢAA基因型與高SCC呈顯著的相關關系，這為檢測奶牛乳腺炎提供了一定的參考依據。

1.4 肝星狀細胞

肝星狀細胞占肝臟固有細胞總數的15%，主要負責代謝和貯存維生素A，并儲存脂肪，從而為肝細胞提供能量[21]。劉一諾[22]研究發現，荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛雜交后代的肝星狀細胞中存在調節脂肪代謝的刺鼠信號蛋白(ASIP)基因，同時指出ASIP基因調節牛乳腺上皮細胞中的脂肪酸代謝過程。在乳房鏈球菌(S.uberis)引起的奶牛乳腺炎中，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路與TLRs/NF-κB信號通路之間的相互作用促進了炎癥反應[23]，因此可以將阻斷PI3K/AKT信號通路作為治療S.uberis型乳腺炎的方案之一。現已有研究表明，褪黑素能夠顯著抑制人類肝星狀細胞中PI3K/AKT信號通路的激活[24]，這為治療S.uberis型奶牛乳腺炎提供了有力支持。

2 肝臟合成并分泌入血的免疫相關活性物質

2.1 補體蛋白

補體蛋白是組成先天免疫系統的重要部分，主要在肝臟中合成。補體被激活之后最終形成膜攻擊復合物，后者通過嵌入感染細胞或者病原體的細胞膜，發揮殺菌作用[25]。所以，奶牛的補體水平在很大程度上反映了奶牛的免疫性能。Min等[26]使用相對和絕對定量同位素標記(iTRAQ)定量蛋白質組學技術比較了熱應激狀態下奶牛的血漿差異，結果發現，熱應激使奶牛的血漿補體蛋白水平明顯下降，免疫功能受到損傷。而且，熱應激還會影響肝臟糖異生基因的表達[27]。Ghaffari等[28]利用定量串聯質量標簽(TMT)方法比較了正常奶牛和過度調理奶牛從妊娠晚期到泌乳早期的血漿差異，蛋白質組學結果表明，過度調理會使奶牛的補體蛋白水平下降，特別是補體3和補體3d水平較低。補體3的水平在血清中很高，在免疫系統中具有核心地位。Jacob等[29]也在亞臨床乳腺炎奶牛的牛乳中發現了補體3的激活，并肯定了其作為亞臨床型乳房炎診斷標記物的潛力。因此，補體蛋白是反映奶牛肝臟健康及機體免疫水平的重要指標。

2.2 免疫調理素

免疫調理素是一種具有調理作用的免疫活性分子，除補體外，還包括CRP、SAA、甘露糖結合凝集素等物質[30]。免疫調理素可與細胞上的特異性受體相互作用，促進吞噬細胞吞噬病原體或病毒感染細胞。在機體發生急性炎癥或被感染時，肝細胞迅速產生急性期蛋白CRP和SAA，二者與免疫細胞上的Fc受體結合介導胞吐作用，從而促進體內大分子物質的清除[5]。Ilievska等[31]研究發現，奶牛的蹄部疾病患病情況，如足跟角糜爛、足底潰瘍、足底皮炎等，與血清中的急性期蛋白有關，特別是HP和SAA，可作為奶牛蹄病早期檢測的有價值的生物標志物。甘露糖結合凝集素相關絲氨酸蛋白酶2(MASP2)是補體系統的功能中心酶，其單核苷酸多態性(SNPs)與奶牛的乳房炎和產奶量有關系。Zhang等[32]指出，在中國荷斯坦奶牛MASP2基因的SNPs中，基因型AC(g.14047A>C)和TT(g.14248T>C)以及單倍型組合H2H2和H2H4可作為奶牛抗乳房炎育種的分子標記。

2.3 脂多糖結合蛋白(LBP)、可溶性CD14和可溶性MD-2

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，與TRL4-MD2復合物結合，激活炎癥信號通路。LPS向TLR4-MD2的轉移是由LBP和CD14共同催化的[33]。CD14是一種錨定蛋白，是LPS的細胞膜受體。LBP與LPS的類脂A高度親和，形成復合物后與CD14識別結合，形成LPS-LBP-CD14三聯復合體[33]。隨后LPS被LBP和CD14轉移到TLR4-MD2復合物中，誘導二聚化，這使得TLR4的胞質Toll/白細胞介素-1受體(TIR)結構域足夠接近，以招募下游銜接分子，如MyD88、含有TIR結構域的接頭蛋白(TIRAP)、含有TIR結構域誘導產生β-干擾素的接頭蛋白(TRIF)和TRIF相關的接頭分子(TRAM)[34]，最終誘導參與宿主免疫反應基因的表達。LPS感染對奶牛機體的影響是多方面的，如LPS以時間依賴方式降低甾醇調節元件結合蛋白1(SREBP1)的表達，誘導奶牛乳腺上皮細胞中的乳脂產量降低[35]；卵泡液中的LPS可能通過破壞類固醇合成和排卵機制誘發奶牛囊性卵巢疾病[36]；LPS能夠誘導奶牛子宮內膜炎，致使受孕率降低、從產犢到第1次分娩的間隔時間增加、因不孕而被淘汰的奶牛數量增加等[37]。

2.4 纖維蛋白原

纖維蛋白原是一種由肝細胞合成的具有凝血和止血作用的糖蛋白，由α、β、γ 3對多肽鏈構成[38]。在凝血酶作用下，α鏈與β鏈分別在細胞中釋放出A肽與B肽，轉化為纖維蛋白單體，最終形成纖維蛋白聚合物[39]。有趣的是，凝血與天然免疫之間存在著重要聯系。越來越多的研究表明，凝血因子不僅起到物理屏障保護的作用，還能控制入侵的微生物保持在局部，阻止其進入血液循環擴散[40]。P?hlman等[40]指出，從纖維蛋白原β鏈釋放的肽段GHR28對與纖維蛋白原結合的細菌具有抗菌活性，但非結合菌株不受影響。這種抗菌作用是通過GHR28對細菌的結合能力實現的，主要針對A組和B組鏈球菌有效，而對金黃色葡萄球菌和卡他莫拉氏菌的作用不明顯。Papareddy等[41]的研究也表明，在纖維蛋白中檢測到的凝血酶衍生肽，可通過膜溶解方式有效地殺滅微生物，在動物模型中對銅綠假單胞菌敗血癥和LPS誘導的休克具有防御作用。在奶牛養殖過程中，乳腺炎致病菌的主要類型有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌。纖維蛋白原多肽在奶牛乳腺炎治療上的應用還未見報道，在治療大腸桿菌以及無乳鏈球菌型奶牛乳腺炎時是否可以將纖維蛋白原多肽作為替代抗生素的選擇值得進一步探究。

3 肝-腦軸

肝-腦軸參與調控多種信號通路。在肝腦炎癥信號通路中，炎癥因子激活肝腦迷走神經，迷走傳入神經將信號投射到大腦。炎癥因子作用于大腦內皮細胞受體，進而激活各自的炎癥信號通路[42]。在肝腦葡萄糖信號通路中，肝-腦軸通過自主神經系統對胰島素的中樞作用從而調節肝臟血糖水平。血糖不僅可以為機體提供能量，而且也是提高機體免疫力的重要部分。曲明姿等[43]研究表明，高產奶牛與低產奶牛相比血糖水平顯著降低，這可能與高產奶牛產奶量大、消耗的糖量大有關。而且，奶牛產后血糖水平也是預測奶牛酮病是否發生的重要指標。而在免疫系統中，自然殺傷(NK)細胞是機體重要的淋巴細胞，能夠迅速釋放穿孔素、細胞因子、腫瘤壞死因子(TNFs)等，非特異性地殺傷異常細胞[44]，并通過調節其他免疫細胞調動機體的天然免疫機能。有研究表明，在高血糖患者的外周血中存在白細胞介素-2(IL-2)受體[45]，其通過阻礙IL-2與NK細胞接觸，降低NK細胞的活性，進而降低機體的免疫力。目前，肝-腦軸對血糖水平的調控在奶牛生產和健康中得到了更多的關注，而其對免疫功能的影響還需要深入探究，因此可以將肝-腦軸在免疫功能中的作用作為創新點，進一步完善奶牛免疫功能的調節機制。

4 小 結

奶牛肝臟免疫是一個復雜的調節過程，涉及到肝臟中的各種免疫相關細胞以及肝細胞合成并分泌入血的免疫相關活性物質，同時肝臟還通過肝-腦軸在奶牛機體免疫中發揮不可替代的作用。奶牛肝臟免疫與許多疾病的發生密切相關，所以，了解奶牛肝臟免疫能夠更好地理解奶牛疾病的誘因、發病機制及治療方法，意義匪淺。