蛋殼形成的鈣代謝機制及其影響因素

張亞男 王 爽 阮 棟 鄭春田

(廣東省農業科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室，廣東省動物育種與營養公共實驗室，廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣州510640)

蛋殼是禽蛋重要的保護殼，保護內容物免受外界應力破損和病菌等微生物的侵染，在種蛋孵化過程中提供鈣源等營養成分，是禽蛋重要的表觀和經濟性狀。蛋殼主要由碳酸鈣和有機基質組成，其中碳酸鈣占蛋殼組分的96%以上，是構成蛋殼結構的重要部分，維持蛋殼的結構和功能[1]。蛋殼的鈣化在子宮內進行，通過鈣化起始、線性沉積和鈣化末期3個階段，逐漸形成蛋殼的乳突層、柵欄層、垂直晶體層和膠護膜，構成完整的蛋殼結構[2]。蛋禽體內鈣的總量為20～23 g，每產1枚蛋需消耗2.2～2.3 g鈣，即每天有10%的鈣需要更換[3]。因此，體內鈣離子的代謝直接影響蛋殼的形成和品質，明確蛋禽體內的鈣代謝機制及影響因素，可為蛋殼品質的調控研究提供思路。

1 蛋殼形成的鈣代謝機制

在蛋殼形成的動態時序過程中，子宮上皮細胞不斷從血液中攝入鈣離子然后分泌到子宮腔內，與碳酸氫根離子共同作用，沉積形成碳酸鈣，而血液中鈣離子一部分通過腸道吸收，另一部分來源于髓質骨(動態鈣源庫)的動員。因此，蛋禽體內鈣離子的代謝及其調控機制，對蛋殼形成和品質具有重要作用。

1.1 鈣離子在腸道的吸收轉運

蛋殼開始鈣化時，腸道內鈣離子濃度大幅度增加，達到12 mmol/L[4]。腸道對鈣離子的吸收主要在十二指腸，對鈣的吸收率達90%，主要通過主動轉運，少部分通過被動擴散進行[5]。鈣離子在上皮細胞的主動轉運主要包括：1)鈣離子通過頂膜上的上皮鈣離子通道(TRPV)順梯度進入細胞；2)通過基底膜上的鈣結合蛋白完成細胞內鈣離子轉運；3)通過基底膜上鈣泵[如轉運載體鈣離子/鈉離子交換器(NCX)和基底外側質膜鈣ATP酶被擠出基膜]主動泵入腸腔內[6]。在此過程中，離子載體發揮重要作用：1)TRPV，蛋雞十二指腸中轉運鈣離子的通道主要是TRPV6[7]，還存在少量的TRPV2，促使鈣離子進入上皮細胞[8]。2)鈣結合蛋白D28k(CALB1)，是鈣轉運的主要蛋白，在腸上皮細胞高水平表達，與腸上皮細胞轉移鈣的能力高度相關[9]。CALB1含量提高主要與卵蛋進入子宮和蛋殼形成有關，鈣的吸收增加，腸道中CALB1的含量及其表達量增加；產軟蛋時，腸道內CALB1含量降低1/2，當蛋殼形成恢復后，CALB1及其mRNA表達水平顯著增加[10]，產蛋停止，腸道CALB1含量下降[9]。3)NCX，主要有NCX1和NCX3，可將鈣離子逆濃度轉運[5-6]。4)鈣泵[鈣離子-ATP酶(PMCA)或ATP]，可利用ATP將鈣離子轉運至細胞外而降低細胞內外電位差，主要有內質網鈣離子泵3 型(ATP2A3)、質膜鈣轉運ATP酶1(ATP2B1)、質膜鈣轉運ATP酶2(ATP2B2)和質膜鈣轉運ATP酶4(ATP2B4)[6]。在上述載體的作用下，大部分的鈣離子被腸道吸收。

1.2 髓骨鈣的形成和動員

蛋禽性成熟后，從飼糧攝入的鈣會優先儲存在髓質骨(包括脛骨、肱骨、股骨)中，作為產蛋期蛋殼形成的動態鈣源，可提供蛋殼約40%的鈣，在低鈣飼糧中，甚至會提供60%的鈣[11]。髓質骨由成骨細胞沉積，約占總骨鈣的11.7%，是一種非結構性骨，缺乏機械抗性，從骨內膜表面生長填滿骨髓腔[12]。髓質骨的礦物鹽含量和結晶度較低，礦物顆粒較薄短[13]，與細胞外有機基質(由非膠原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖組成)相互作用，作為鈣的動態儲存庫，有機基質是髓質骨快速礦化和脫礦的重要條件。髓質骨的表面積大，血管密集，代謝速率是皮質骨的10～15倍[12]。髓質骨的這些特性，成為蛋殼鈣化過程中的重要動態來源，尤其在蛋殼鈣化末期，由于夜間飼糧鈣供應不足，髓質骨大量破骨產生鈣離子供蛋殼形成。隨著蛋禽年齡的增加，腸道對鈣的吸收量減少且機體利用骨鈣的能力下降[14]，蛋禽體內每天有10%的鈣需要更換，當吸收的鈣或利用的骨鈣不足以達到蛋殼形成所需，就會出現產蛋減少，蛋殼變薄、變脆的現象，甚至產生軟殼蛋、無殼蛋等[15]。因此，髓骨鈣的形成和動員，也是影響蛋殼品質形成過程中鈣離子代謝的重要因素。

1.3 鈣離子在子宮的轉運分泌

子宮內鈣離子的分泌是影響蛋殼碳酸鈣沉積的直接因素。產卵后6～22 h，碳酸鈣以0.33 g/h的速度線性沉積在蛋殼腺(子宮)內。子宮鈣離子的分泌不是持續的，與排卵過程同步，當卵到達子宮時，受到刺激啟動鈣離子的分泌[5]。蛋殼鈣化階段，血漿鈣離子濃度(1.2 mmol/L)與子宮腔中鈣離子濃度(6～10 mmol/L)之間存在較大的濃度差[16]。鈣離子在子宮部位的轉運分泌，主要通過管狀腺細胞，逆濃度梯度向子宮腔內轉移大量的鈣離子，同時保持細胞內低濃度的鈣(<0.000 2 mmol/L)。上皮管狀腺細胞分泌的鈣離子主要涉及TRPV(細胞攝取/進入)、CALB1(細胞內轉移)、內質網鈣離子泵2型(ATP2A2)和ATP2A3(內質網攝取)以及肌醇三磷酸受體1型、2型和3型(ITPR1、ITPR2和ITPR3，由網狀細胞輸出)，然后通過ATP2B1和ATP2B2以及NCX1和NCX3(SLC8A1和SLC8A3)將鈣離子從腺細胞中泵出。與十二指腸上皮細胞不同，子宮管狀腺細胞中可能不存在TRPV6，而TRPV2和TRPV3可能是鈣通道的重要離子載體[17]，但有待進一步確定。與腸道相比，蛋殼腺管狀腺細胞鈣離子分泌的載體更多更復雜，還存在許多其他載體，如碳酸酐酶7，可促進碳酸氫根離子生成；鈉離子/碳酸氫根離子轉運蛋白，主要有溶質載體家族4成員5(SLC4A5)、成員7(SLC4A7)、成員9(SLC4A9)；鈉離子通道，主要有氨酰敏感鈉通道亞基α(SCNN1A)、亞基β(SCNN1B)、亞基γ(SCNN1G)等。鈣和碳酸氫鹽從血液轉移到子宮，需要額外的離子運動來維持細胞的穩態。大電流的鈉離子、鉀離子和氯離子有助于維持細胞內的生理離子濃度。鈉離子通過NCX和頂膜上對氨基離子敏感的鈉離子通道從子宮液中吸收，通過鈉離子/鉀離子-ATP酶在電化學梯度作用下從基底外側膜細胞中泵出，鈉離子/鉀離子-ATP酶可轉運鈉離子和鉀離子進入細胞[16,18]。這些載體基因(ATP2A3、ITPR1、SCNN1A、SCNN1B和SCNN1G)多態性之間的關聯證明，其與蛋殼力學特性(強度、厚度和蛋殼重量)有關，證明它們參與了蛋殼礦化前體的供應[19]。腸道主要吸收鈣離子，子宮主要分泌鈣離子，都是通過轉運載體而發揮作用，二者載體存在一些相似性，但子宮細胞的載體更加復雜，然而各離子之間的相互關系和作用，仍需深入研究。

2 蛋殼形成過程中鈣代謝的影響因素

2.1 維生素D及其代謝產物1,25-二羥維生素D3

維生素D及其代謝產物1,25-二羥維生素D3是調控鈣離子在腸道上皮細胞吸收的重要因子，可促進腸上皮細胞頂端鈣離子的滲透，及在細胞內的胞質轉運和排出[9]。蛋禽腸道存在1,25-二羥維生素D3和維生素D受體(VDR)[20]。CALB1作為腸道鈣離子轉運的主要蛋白，是一種維生素D依賴型蛋白，飼糧缺乏維生素D，腸道中幾乎檢測不到鈣結合蛋白，但注射1,25-二羥維生素D3，鈣結合蛋白的基因表達增加了10倍[21]。蛋禽性成熟后產第一枚蛋前，血漿1,25-二羥維生素D3含量增加，腸道中鈣結合蛋白及其表達量增加，鈣吸收增加[10]。此外，研究表明，PMCA1的合成也受維生素D影響，其基因與維生素D受體反應元件有關[22]。但其他鈣離子轉運載體并未發現受1,25-二羥維生素D3的調控。腸道中雖然已經發現了許多假定的離子轉運體，但關于這些候選分子在特定離子轉運體(通道、泵或交換器)之間的相互作用并不清楚。維生素D代謝物對蛋雞鈣結合蛋白和PMCA表達的影響已得到證實，但其他參與鈣吸收和腸細胞離子穩態的蛋白的作用仍有待進一步研究。

腸道鈣的吸收直接受維生素D的控制，子宮內則不同。鈣結合蛋白也是子宮管狀腺細胞鈣離子轉運分泌的主要蛋白，在蛋殼形成過程中大量表達[16]，但子宮中的鈣結合蛋白表達是否受維生素D的影響，還存在爭議。外源性1,25-二羥維生素D3或低鈣飼糧不會影響子宮鈣結合蛋白的水平[9]，飼喂缺乏維生素D的飼糧，鵪鶉子宮內仍有CALB1的合成[23]，但也有研究發現，在體外培養維生素D缺乏蛋禽子宮組織的培養基中添加1,25-二羥維生素D3或與雌激素共同作用，又可刺激鈣結合蛋白的表達，這表明1,25-二羥維生素D3對鈣結合蛋白合成有促進作用，并且子宮細胞存在VDR，并在蛋殼鈣化時表達增加[24]。蛋殼形成時，除了鈣離子和碳酸氫根離子的載體，許多參與蛋殼前體分泌或維持細胞內穩態的離子轉運蛋白上調。且多數轉運蛋白的基因中都存在VDR，表明可能也受維生素D影響。但維生素D及其代謝產物1,25-二羥維生素D3對子宮細胞鈣離子轉運分泌載體的調控作用有待進一步研究。

髓骨和皮質骨之間的平衡受飼糧鈣和維生素D的影響[12]。維生素D對骨礦化具有重要作用，提高鈣磷吸收，促進某些骨基質蛋白的合成，如骨鈣素和骨橋蛋白。骨鈣素是與骨礦化基質相關的最豐富的非膠原蛋白，可與鈣結合，對羥基磷灰石有較強的吸附力[25]。骨橋蛋白是一種糖基化、高度磷酸化的蛋白，存在于骨和蛋殼中[26]。在骨中，骨橋蛋白可影響破骨細胞的分化和形成。1,25-二羥維生素D3通過與特定的維生素D反應啟動子元件結合，促進骨鈣素和骨橋蛋白的合成，從而增加成骨細胞[6]。因此，髓骨鈣的合成和動員受維生素D及其代謝產物1,25-二羥維生素D3的調控。

應用研究中表明，維生素D3是維持蛋禽正常生長、繁殖和蛋殼品質的重要因素[27]，可調控鈣磷吸收，調節甲狀旁腺激素的分泌、骨礦化和動員，減少骨疾病的發生[28]。蛋雞飼糧缺乏維生素D3，體內鈣磷代謝降低，蛋雞的產蛋性能和蛋殼品質降低，死亡率增加[29]。隨著產蛋日齡的增加，蛋禽體內鈣吸收和維生素D3代謝能力降低[30]，導致體內1,25-二羥維生素D3不足，影響鈣磷代謝，導致蛋殼質量和骨強度降低[27]。在產蛋后期，飼糧添加維生素D3可提高蛋殼強度、厚度、蛋殼比例和脛骨強度，降低破蛋率[31]。飼糧添加維生素D3、維生素D2、1,25-二羥維生素D3可提高蛋雞體內鈣和磷的總表觀消化率[32]。飼糧添加維生素D3(2 400 vs. 300 IU/kg)可提高蛋雞的蛋殼密度和厚度[33]，但也有研究表明飼糧添加維生素D3(2 200～102 020 IU/kg)對蛋雞的蛋殼品質和骨性能無顯著影響[34]。

2.2 雌激素

雌激素是確保蛋殼形成的先決條件，刺激輸卵管和子宮的生長發育，并激活卵巢每日控制子宮分泌鈣的能力，隨著蛋殼形成不斷變化，并與蛋殼形成一致[3]。管狀腺細胞存在雌激素受體和鈣結合蛋白，子宮CALB1的含量受雌激素調控，影響子宮的鈣分泌。雌激素是影響髓骨形成的關鍵因素，成骨和破骨細胞中都存在雌激素受體，可誘導骨內膜細胞分化形成成骨細胞，降低骨內膜表面破骨細胞數量及活性[35]。蛋禽性成熟時，雌激素大量分泌，髓質骨較皮質骨比例增加[12]，雌激素還可誘導骨基質形成，但需與維生素D3共同作用。維生素D是促進皮質骨和髓質骨成骨細胞活動的關鍵因素，但2種骨之間的平衡受雌激素的調節，通過調控血管系統和交換表面積[12]。此外，維生素D參與髓質骨形成，在成骨細胞中，雌激素可增加維生素D受體表達刺激骨鈣素分泌，并與維生素D共同作用，促進髓質骨形成。產蛋后期，蛋殼品質和骨性能降低，這可能與蛋殼腺上皮細胞的雌激素受體(α和β)之間的平衡改變有關，若連續低劑量的注射雌激素，可改善蛋雞的蛋殼強度[36]。因此，雌激素也是影響蛋殼鈣代謝和形成的重要因素。

2.3 骨鈣素、甲狀旁腺素、成纖維細胞生長因子23(FGF23)

飼糧鈣供應不足時，髓質骨是蛋殼形成的動態鈣庫[35]。蛋殼形成過程中(產卵10～22 h)，破骨細胞活躍，髓質骨被大量吸收，吸收面積增加了9倍，血漿和尿中磷含量大幅增加[6]。骨鈣素主要由成骨細胞合成，參與鈣循環，并可得到快速周轉。血漿中骨鈣素含量變化與1,25-二羥維生素D3有關，產無殼蛋蛋禽血漿中的骨鈣素和1,25-二羥維生素D3含量均較低[37-38]。低鈣飼糧中，蛋殼的形成會促進骨鈣素的分泌。血漿骨鈣素可反映成骨細胞的日周期活動，在成骨細胞中，雌激素通過增加VDR表達刺激骨鈣素的分泌。飼糧添加維生素K可通過骨鈣素改善骨組織代謝的失衡狀態，促進骨形成和抑制骨細胞吸收的雙向調節[39]，但對蛋殼品質的調控研究有待進一步研究。骨的重吸收日常變化還受甲狀旁腺素(PTH)的控制[35]。在蛋殼形成期間，由于血漿中鈣離子的降低，PTH的分泌增加，可強烈刺激骨吸收[35]。FGF23是一種調節骨鈣和磷代謝的激素，調控骨橋蛋白等的表達[38]，FGF23主要在成骨和破骨細胞中表達，可抑制腎小管中磷酸鹽的再吸收，還可通過雙重作用降低1,25-二羥維生素D3的循環[38]。然而，FGF23在蛋禽體內蛋殼形成過程中的具體作用并不清楚，但FGF23及其輔助因子可能參與蛋禽腎臟中磷酸鹽和1,25-二羥維生素D3的每日變化[40]。因此，調控影響骨礦化和破骨的激素水平，可調控骨鈣磷代謝，影響體內鈣代謝。

髓骨鈣的儲存也是影響蛋殼鈣代謝的重要因素。關注育成期蛋禽的骨骼發育，保證產蛋后期髓骨鈣的供應，是調控后期蛋殼品質的重要方向。通過調控鈣磷代謝而影響碳酸鈣的沉積是改善后期蛋殼品質的研究重點。研究表明，飼糧添加鋅[41]、枯草芽孢桿菌[42]、有機酸和中草藥添加劑[43]以及調控飼糧鈉氯水平[44]、使用硫酸鈉部分代替氯化鈉[45]等，可改善產蛋后期的蛋殼品質，主要是調控碳酸鈣的沉積，通過促進鈣離子的吸收轉運和降低骨鈣流失等發揮作用。

3 小 結

蛋殼品質受鈣磷代謝的影響受到廣泛關注，通過調控鈣源和水平、鈣磷比例、添加維生素等調控蛋殼品質，也已廣泛應用于生產實踐。但仍有許多問題有待進一步研究和探討，歸結起來主要有如下4個方面：1)腸道和子宮部上皮細胞仍然存在許多未鑒定或功能不清楚的離子載體，通過組學技術與表型數據的關聯分析，有助于發現或解析其在蛋殼形成的功能和作用途徑。2)子宮上皮細胞鈣離子的分泌，不僅需要鈣離子轉運載體，還與其他離子的轉運和平衡有關，可從整體上，調控離子穩態平衡而改善蛋殼品質。3)蛋殼鈣化的動態時序性過程中，需要持續不斷的提供大量的鈣離子，受體內鈣穩態的調控，受1,25-二羥維生素D3、雌激素、降鈣素、PTH和鈣離子調節等影響。然而，激素水平的變化受多種因素影響，如何應用營養手段進行調控，仍然是研究的重點和難點。4)通過調控鈣離子在腸道的吸收轉運而改善蛋殼品質已進行大量研究，但關于調控髓骨鈣的形成和動員的研究很少，這將是未來蛋殼品質研究的新方向。