食品檢測(cè)中PCR技術(shù)的應(yīng)用研究

◎ 鄭 昆，楊 紅（．吉林化工學(xué)院 工程學(xué)院，吉林 吉林 30；．吉林通用航空職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 3000）

PCR技術(shù)的全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，能夠迅速擴(kuò)增指定基因的DNA序列，最早應(yīng)用于基因克隆、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)等領(lǐng)域。由于PCR技術(shù)的精準(zhǔn)性較強(qiáng)，逐步被應(yīng)用到其他的領(lǐng)域。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們?nèi)遮吜私饬耸澄镏形⑸锏倪z傳性質(zhì)，因此也開(kāi)始在食品檢測(cè)領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用PCR技術(shù)。其中，食品中致病菌檢測(cè)、成分類別鑒定、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等是PCR技術(shù)的主要應(yīng)用方向。

1 PCR技術(shù)的應(yīng)用原理及關(guān)鍵環(huán)節(jié)

1.1 應(yīng)用原理

在基因工程領(lǐng)域，PCR技術(shù)是非常關(guān)鍵的一項(xiàng)技術(shù)，目前在食品檢測(cè)中得到了十分廣泛的應(yīng)用。本技術(shù)主要依托PCR體系增溫處理需檢測(cè)的食物，在增溫過(guò)程中，改變食物中微生物的核酸序列。一般來(lái)講，在94 ℃的初始溫度條件下即可裂解微生物的DNA，隨后分別進(jìn)行降溫與增溫處理，產(chǎn)生新的DNA片段。通過(guò)對(duì)獲得產(chǎn)物的特異性DNA片段進(jìn)行檢查，即可完成食物檢測(cè)任務(wù)。

通常情況下，可從這些方面劃分PCR技術(shù)的應(yīng)用流程。①通過(guò)對(duì)離心法、過(guò)濾法等進(jìn)行運(yùn)用，有效純化、提取食品中的DNA。②基于PCR技術(shù)的支持，擴(kuò)增處理DNA。③深入分析擴(kuò)增到的產(chǎn)物，分析步驟包括變性、退火與延伸。變性階段主要是拆分食品DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，退火階段主要是配對(duì)結(jié)合引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列，而延伸階段則可促使新的特征性成分DNA得到形成[1]。

1.2 關(guān)鍵環(huán)節(jié)

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

PCR的擴(kuò)增特異性會(huì)在很大程度上受到引物設(shè)計(jì)的影響，在食品致病菌、非致病菌檢測(cè)過(guò)程中，試驗(yàn)對(duì)樣本的擴(kuò)增特異性提出了較高的要求，若擴(kuò)增特異性不足，那么PCR檢測(cè)結(jié)果的精確性將難以保證。因此，在應(yīng)用PCR技術(shù)的過(guò)程中，要充分重視引物設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)。其中，引物設(shè)計(jì)質(zhì)量受食品遺傳背景的影響較大，工作人員需深入分析檢測(cè)對(duì)象的遺傳背景。通常情況下，經(jīng)驗(yàn)豐富的檢測(cè)人員能夠深入掌握常見(jiàn)食品的遺傳背景，部分食品較為特殊，則要對(duì)其檢測(cè)背景進(jìn)行特意分析與了解[2]。

1.2.2 模板制備

PCR技術(shù)的應(yīng)用結(jié)果會(huì)受到模板制備質(zhì)量的影響，在制備過(guò)程中，工作人員要清除掉樣本中的PCR抑制分子，移除掉DNA蛋白與有機(jī)溶劑，以便促使樣本檢測(cè)質(zhì)量得到提高。

2 食品檢測(cè)中PCR技術(shù)的主要應(yīng)用

2.1 食品致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

在食品檢測(cè)體系中，非常關(guān)鍵的項(xiàng)目為致病菌檢測(cè)。傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的實(shí)施環(huán)節(jié)眾多，如富集培養(yǎng)、分離培養(yǎng)等，需花費(fèi)較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間，一般要在5 d以上，這樣食品檢測(cè)的時(shí)效性將會(huì)大打折扣。而通過(guò)應(yīng)用PCR技術(shù)，則可在很大程度上提高檢測(cè)效率。PCR技術(shù)只有較少的檢測(cè)環(huán)節(jié)，檢測(cè)時(shí)間可以壓縮在1 d以內(nèi)。在具體實(shí)施中，先利用電泳法對(duì)0.1 mg DNA中拷貝模板程序數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，之后借助于PCR技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增細(xì)菌中的殘留DNA片段。在這一檢測(cè)過(guò)程中，致病菌培養(yǎng)環(huán)節(jié)得到省略，檢測(cè)程序較為簡(jiǎn)單。檢測(cè)流程如下。①通過(guò)對(duì)離心沉淀、濾膜過(guò)濾等技術(shù)進(jìn)行綜合利用，深入分析食品樣本中的細(xì)菌細(xì)胞。②實(shí)施細(xì)胞裂變，以便對(duì)細(xì)胞中的DNA進(jìn)行獲取。③借助于特異性核酸探針、電泳法等檢測(cè)DNA序列，將細(xì)菌種類、數(shù)量等確定出來(lái)[3]。

最早PCR技術(shù)應(yīng)用于沙門氏菌檢測(cè)中，目前檢測(cè)技術(shù)日趨成熟，沙門氏菌的檢測(cè)需求可以得到充分滿足。且在實(shí)踐發(fā)展中形成了很多新的檢測(cè)方法，如多重PCR檢測(cè)技術(shù)等。同時(shí)，在很大程度上拓展了PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍，通過(guò)結(jié)合使用基因探針、PCR技術(shù)等，可高效檢測(cè)金黃色葡萄球菌等致病菌，得到準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)結(jié)果。

2.2 食品非致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)能夠檢測(cè)食品中的非致病菌，目前主要應(yīng)用于食品中乳酸菌檢測(cè)領(lǐng)域。乳酸菌的種類較多，分布較廣，生物化學(xué)價(jià)值較高。結(jié)合研究得知，大部分乳酸菌有益于人體健康，但也存在著許多有害乳酸菌。乳酸菌的環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，甚至能夠長(zhǎng)期生存于真空環(huán)境中。因此，有益乳酸菌一般作為添加劑、防腐材料等應(yīng)用于食品生產(chǎn)中，使食物的腐敗率得到有效降低，食物的保質(zhì)期得以延長(zhǎng)。在食品乳酸菌檢測(cè)中應(yīng)用PCR技術(shù)時(shí)，要對(duì)乳酸菌的產(chǎn)生規(guī)律進(jìn)行準(zhǔn)確把握，獲取乳酸菌的菌落信息后，借助于引物設(shè)計(jì)對(duì)乳酸菌的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行檢查，從而了解乳酸菌類型以及保質(zhì)期內(nèi)的腐敗度等[4]。此外，在生物實(shí)驗(yàn)室中也可借助于PCR技術(shù)檢測(cè)乳酸菌含量，如檢測(cè)酸奶食品等。結(jié)合實(shí)踐得知，PCR技術(shù)能夠?qū)κ称分械娜樗峋窟M(jìn)行較為準(zhǔn)確的測(cè)定。

2.3 轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的應(yīng)用

現(xiàn)階段，食品工程中開(kāi)始廣泛應(yīng)用基因工程技術(shù)，市場(chǎng)中出現(xiàn)了較多種類的轉(zhuǎn)基因食品，如大豆、玉米等。為促使轉(zhuǎn)基因食品的質(zhì)量安全得到保證，消除社會(huì)公眾的誤解，需要對(duì)轉(zhuǎn)基因食品中的成分進(jìn)行定性與定量分析。而PCR技術(shù)的檢測(cè)操作難度較小，整體檢測(cè)效率較高，已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)當(dāng)中。

2.4 食品有效成分檢測(cè)中的應(yīng)用

社會(huì)公眾日趨關(guān)注食品質(zhì)量問(wèn)題，在食品選購(gòu)時(shí)往往要認(rèn)真觀察食品的營(yíng)養(yǎng)成分表。但人們難以利用肉眼檢測(cè)出食品真實(shí)的營(yíng)養(yǎng)成分狀況，因此部分企業(yè)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行虛假標(biāo)注。針對(duì)這種情況，可借助于PCR技術(shù)準(zhǔn)確檢測(cè)、鑒別食品中的營(yíng)養(yǎng)成分及含量，促使消費(fèi)者的知情權(quán)得到保證。此外，利用PCR技術(shù)也能夠有效檢測(cè)肉類及其制品的動(dòng)物成分，對(duì)可能含有的其他動(dòng)物性成分進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別，進(jìn)而提高各類食品的質(zhì)量安全水平。

3 PCR技術(shù)應(yīng)用時(shí)的注意事項(xiàng)

為將PCR技術(shù)的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)充分發(fā)揮出來(lái)，提高食品檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，需嚴(yán)格管控檢測(cè)過(guò)程，明確關(guān)鍵事項(xiàng)。

3.1 有效制備PCR模板

沒(méi)有科學(xué)制備PCR模板，那么食品安全檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性將得不到保證。主要原因是有數(shù)萬(wàn)種PCR抑制因子存在于食品與生活環(huán)境中，如果沒(méi)有將PCR模板中的抑制因子清除掉，那么DNA提取過(guò)程將會(huì)受到影響，且無(wú)法全面去除掉蛋白質(zhì)有機(jī)溶劑，難以完整提取DNA，無(wú)法反映檢測(cè)對(duì)象的致病菌、非致病菌的真實(shí)狀況，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性得不到保證。

3.2 充分重視檢測(cè)污染問(wèn)題

樣本采集是食品檢測(cè)的重要環(huán)節(jié)，一旦有污染問(wèn)題出現(xiàn)于樣本采集、運(yùn)輸過(guò)程中，即便應(yīng)用先進(jìn)的PCR技術(shù)，也難以對(duì)食物的真實(shí)質(zhì)量安全狀況進(jìn)行反映。同時(shí)，在PCR技術(shù)檢測(cè)過(guò)程當(dāng)中，也可能會(huì)污染樣本或模板。因此，需要工作人員將無(wú)菌控制要求貫徹于檢測(cè)操作全過(guò)程中，對(duì)槍頭進(jìn)行及時(shí)更換，避免出現(xiàn)交叉污染、樣品污染等問(wèn)題，促使食品檢測(cè)結(jié)果的客觀性、準(zhǔn)確性等得到保證。

3.3 保證檢測(cè)對(duì)象的生物活性

如果檢測(cè)對(duì)象的生物活性難以得到保持，將會(huì)在很大程度上影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在檢測(cè)核酸物質(zhì)食品時(shí)，保持食品的生物活性才可以對(duì)DNA信息進(jìn)行有效提取，進(jìn)而促進(jìn)PCR擴(kuò)增的順利實(shí)現(xiàn)[5]。

4 食品檢測(cè)中PCR的改進(jìn)技術(shù)

4.1 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR的過(guò)程。由于模板的Ct值與模板的起始拷貝數(shù)之間存在一定的線性關(guān)系，因此可進(jìn)行定量分析。此技術(shù)于完全閉管條件下開(kāi)展，且PCR后的處理工序得到省略，可避免交叉?zhèn)魅締?wèn)題的出現(xiàn)。同時(shí)，檢測(cè)周期得到了顯著縮短，操作難度較小，能夠獲取到準(zhǔn)確、特異的檢測(cè)結(jié)果。目前，在食品病原微生物檢測(cè)、摻加量檢測(cè)等領(lǐng)域應(yīng)用較多。

4.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是將多對(duì)引物加入到反應(yīng)系統(tǒng)中，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)DNA片段擴(kuò)增目的。各個(gè)目標(biāo)片段具有差異化的大小，通過(guò)多重?cái)U(kuò)增，可直接分析凝膠成像。和常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)相比，本種技術(shù)能夠同時(shí)擴(kuò)增多目標(biāo)DNA片段，可促使模板DNA、檢測(cè)時(shí)間、檢測(cè)成本等得到有效節(jié)約。

4.3 PCR-DGGE技術(shù)

PCR-DGGE技術(shù)有機(jī)結(jié)合了PCR技術(shù)與變形梯度凝膠電泳技術(shù)，能夠分離長(zhǎng)度相同的不同堿基的DNA片段。PCR-DGGE技術(shù)具有較強(qiáng)的特異性和敏感性，可有效分辨堿基。依托成像體系分析經(jīng)過(guò)染色后的凝膠，能夠?qū)悠返姆爆嵭越o反映出來(lái)。而借助于條帶數(shù)量，可反映樣品中不同微生物的組成，依據(jù)條帶亮度能夠?qū)ξ⑸飻?shù)量進(jìn)行掌握。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，傳統(tǒng)食品檢測(cè)技術(shù)具有較為繁瑣的操作步驟，需花費(fèi)大量的時(shí)間和精力，且不具備良好的靈敏度。而PCR技術(shù)則能夠有效簡(jiǎn)化食品安全檢測(cè)流程，增強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。因此，PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中應(yīng)用十分廣泛，促進(jìn)了食品檢測(cè)業(yè)的快速發(fā)展。為切實(shí)凸顯PCR檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，工作人員要嚴(yán)格依據(jù)相應(yīng)的流程和規(guī)范開(kāi)展食品檢測(cè)工作，嚴(yán)格控制各個(gè)檢測(cè)環(huán)節(jié)。