生防細菌殺松材線蟲的作用機制及應用

張弘弢趙宇李曉巖牛犇

(1.東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150040；3.牡丹江師范學院化學化工學院，黑龍江牡丹江 157011)

松材線蟲病又稱松樹枯萎病(Pine wilt disease，PWD)，是由松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus引起的一種全球性森林病害，可危害70種針葉樹，其中松屬Pinus樹種57種，非松屬樹種13種[1]。松材線蟲病可導致樹脂管周圍空化和無法修復的木質部導管功能障礙[2]，該病危害性極大，被稱為“松樹的癌癥”，已成為我國近幾十年來發生的最嚴重、最危險的林業病害[3]。松材線蟲作為外來入侵林業檢疫性有害生物，對我國主要針葉綠化樹種造成的經濟損失和生態影響巨大，松褐天牛Monochamus alternatus是松材線蟲最主要的傳播媒介，分析松褐天牛種群發生動態能夠評估松材線蟲病的災變風險[4-6]。目前防治策略多以防治松褐天牛為主，亟需建立松材線蟲病高效防控技術體系。

當前防治松材線蟲病的主要措施包括疫木粉碎、熏蒸、焚燒與施用化學藥劑，通過直接或間接殺死傳播媒介松褐天牛等。粉碎、熏蒸與焚燒疫木過程中的監管疏漏將會加速該病害的擴散[7-8]；化學藥劑的殘留，不僅會造成耐藥病原物的產生，加大防控難度，而且會對環境造成沉重負擔；有些防治辦法在殺死松褐天牛的同時，也會殺死大量害蟲天敵，造成其他蟲害的發生。生物防治是指利用有益生物及其代謝產物防治有害生物的一種重要策略，具有防病功能的有益微生物菌株已被廣泛應用于植物病害防控。生物防治松材線蟲不僅能夠從源頭上遏制松材線蟲病的蔓延，還能降低防治松褐天牛帶來的危害。利用細菌防治植物病蟲害具有安全環保、對病原生物高度特異性，調節土壤細菌群落，提高其抗逆能力等優點，有利于防治工作可持續發展。國內外廣泛利用細菌及其代謝產物防治松材線蟲病，使松材線蟲病的生物防治策略迅速發展[9-12]。目前，已被廣泛商品化的殺線蟲細菌菌株主要來自于熒光假單胞Pseudomonas fluorescens，芽胞桿菌屬Bacillus、放線菌Actinomycetes、巴氏桿菌屬Pasteuria等[13-14]。采用枯草芽胞桿菌Bacillus subtilisB006的無菌代謝產物處理根結線蟲Meloidogynespp.2齡幼蟲(J2)48 h后的致死率達100%，對黃瓜根結線蟲病的防治取得了良好效果[15]；放線菌S07不僅對小麥胞囊線蟲Heterodera avenae具有防治效果，而且能夠在盆栽與田間條件下防控番茄根結線蟲[16-17]；枯草芽胞桿菌AR11能夠防控南方根結線蟲Meloidogyne incognita[18]，進一步研究發現，將該菌株與芽胞桿菌NJ08、NJ218混合制成GJ23復合菌劑，能有效抑制蟲卵的產生[19]，在田間試驗中，該復合菌劑對根結線蟲的防病效果達到51.9%[20]。

深入研究生防細菌的作用機理，能夠促進生防菌劑應用與商品化；通過對生防細菌及其代謝產物的研究，能夠大規模生產有效的生防制劑，節約經濟成本；進一步對生防細菌的分子生物學特性與毒力基因的研究，可生產有效性、專一性、針對性更強的生防制劑；現代發酵技術加快了生防菌劑工廠化生產和商品化應用，這使以防為主，防治并舉，防重于治的理念得到進一步的完善。為使生防細菌在防治松材線蟲病過程中達到更好的作用效果，需對其與松材線蟲的相互作用機理有更深入的了解。

1 細菌殺松材線蟲的作用機制

松材線蟲是一種遷移性內寄生蟲，具有復雜的生命周期。當環境適宜時，松材線蟲卵經過繁殖型1～4齡幼蟲階段發育為成蟲。當食物匱乏和線蟲密度過高時，不同于秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis Elegans從繁殖型2齡幼蟲進入dauer期，松材線蟲會進入一個類似于dauer期的擴散階段，繁殖型2齡幼蟲蛻皮到D3階段[21-22]，D3階段線蟲可在病媒甲蟲身體中蛻皮為D4階段[23-24]。使用RNA-seq對松材線蟲的所有發育階段進行了全面的轉錄組分析，其中9 000個基因與一般線蟲生物學沒有差異，分散階段的轉錄組與秀麗隱桿線蟲相似[25]。根結線蟲在植物根表形成傷口進行侵染，D4階段的松材線蟲也能通過媒介昆蟲松褐天牛在啃食樹皮上留下傷口，通過傷口傳播到新的健康寄主樹上[26-27]。松材線蟲與大豆胞囊線蟲Heterodera glycines、根結線蟲同屬植物寄生線蟲。細菌殺其他線蟲的作用機制可能也適用于松材線蟲。

細菌殺線蟲的主要作用機制包括毒素致死、消解線蟲體表組織、干擾線蟲行為模式、捕食線蟲與細菌動員真菌捕食線蟲等。細菌可以通過一種或者多種作用機制殺死線蟲。

1.1 毒素致死 蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis(Bt)作為微生物源低毒殺蟲劑，以腸毒作用為主。該菌產生的毒素能使線蟲腸道潰瘍，停止取食，最后線蟲因饑餓和神經中毒死亡。

蘇云金芽胞桿菌可產生多種具有殺蟲作用的伴胞晶體蛋白毒素，主要包括α-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素和δ-內毒素，其中β-外毒素和δ-內毒素具有線蟲致死活性。線蟲吞食的伴胞晶體蛋白毒素，在腸道堿性條件(pH＞10)下，可被某些酶降解為毒素核心(toxin core)，分子量65～75 kD。毒素核心與線蟲腸道上皮的受體相結合，并插入到細胞膜上形成離子通道，導致滲透平衡破壞，引起腸內膜滲透性增大，破壞線蟲腸道組織，線蟲蟲體發生腫脹并裂解，最終導致線蟲死亡[28-29]。

δ-內毒素，主要分為Cry(crystal)和Cyt(cytolyic)兩類[30]。Cry毒素可與位于線蟲腸道細胞膜表面的特定受體相互作用，并在與受體結合后被腸道細胞內的蛋白酶激活，從而形成具有插入能力的孔前寡聚結構；Cyt毒素直接與線蟲腸道細胞膜脂質相互作用并插入膜中，形成液泡和孔，并最終導致腸道表皮細胞的降解[31]。

此外，蘇云金芽胞桿菌毒素可導致線蟲中毒。中毒跡象包括線蟲腸道細胞收縮和變薄，與體壁細胞形成空泡，線蟲本身蟲體失水皺縮，體積縮小，行動遲緩，缺乏活力[32]。

1.2 消解線蟲體表組織 松材線蟲的成蟲體表覆蓋著致密非細胞表皮，能夠保護線蟲免受外界侵害，細菌產生的蛋白酶能消解破壞表皮和皮下組織，一旦表皮以及組織受到破壞，就會加速線蟲死亡。

側胞短芽胞桿菌Brevibacillus laterosporus和熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens等分泌的細胞外蛋白酶，能在線蟲的體表形成孔洞，并由表皮細胞向內連續降解并消化內部組織[33-35]。人們熟知的芽胞桿菌產生的胞外蛋白酶通過此類作用機制殺死線蟲，例如蠟樣芽胞桿菌BCM2產生的外排型蛋白酶可以同時傷害線蟲表皮和卵膜，導致線蟲表皮角質層斷裂，形成表皮傷口，卵的發育或停滯在單細胞階段，或發生不規則的細胞分裂，從而殺死線蟲并阻斷線蟲繁殖[36]。

此外，沙雷氏菌Serratiasp.A88copa 13可產生外排型蛋白酶，在掃描電鏡下可以觀察蛋白酶沉積物黏附在松材線蟲表皮，引起皮內層折疊和褶皺，破壞松材線蟲表皮細胞結構，導致線蟲死亡[37]。從土壤中分離獲得的嗜麥芽寡養單胞菌Stenotrophomonas maltophiliaG2也有類似的作用，其產生的胞外絲氨酸蛋白酶可作用于松材線蟲的表皮細胞，使其逐漸裂解消失，體內細胞形成空泡，最終蟲體基本消失[38]。

這種作用方式能導致線蟲死亡，對正常生長發育的線蟲重創，這種傷害是不可逆，不能自我修復的。

1.3 干擾線蟲行為模式 松材線蟲繁殖和擴散階段分泌的信號因子，能夠保證線蟲正常的生長活動，細菌具有的揮發性小分子化合物能夠代替信號分子，結合線蟲神經元干擾線蟲代謝途徑。細菌產生的胞外多糖能抑制線蟲的運動，通過降低線蟲爬行速度來減弱線蟲的定殖能力，從而減少侵染寄主植物的線蟲種群數量。

芽胞桿菌R2產生的次級揮發性代謝產物苯乙烯，可影響松材線蟲的嗅覺神經元和G蛋白信號代謝途徑，造成松材線蟲神經系統紊亂，導致松材線蟲死亡[39]。

多粘類芽胞桿菌PaenibacilluspolymyxaKM2501-1可通過產生多種揮發性代謝產物，誘捕并殺死線蟲，其產生的糠醛丙酮和2-癸醇能夠吸引線蟲，起到“蜂蜜陷阱”的作用[40]。

細菌通過產生包裹其整個群落的外聚合基質形成生物膜。銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa生物膜中含有的胞外多糖Psl能夠抑制線蟲的運動，Psl通過降低線蟲的爬行速度來減弱線蟲的定殖能力，能夠將線蟲捕獲在基質中，使線蟲既不能從惡劣環境中逃脫，也不能向有利環境遷移[41]。這種作用方式降低了線蟲在植物上的定殖，有效減少了線蟲的種群數量。

1.4 捕食線蟲細菌 覆蓋在線蟲角質層最外層的表皮層，由各種非結構性的皮下分泌物修飾而成，含有大量的微量元素，膠原和糖蛋白[42]。細菌通過爭奪環境中的微量元素，使線蟲不能合成構成表皮層需要的結合蛋白，細菌也能夠利用線蟲產生的膠原和糖蛋白產生生物膜，供自己生長繁殖。

穿刺芽孢桿菌Pasteuria penetrans的孢子附著在線蟲幼蟲的表皮表面，通過爭奪環境中的硒(Se)元素，使線蟲表皮缺乏硒結合蛋白(SeBPs)。當幼蟲長到成蟲期時，孢子長出胚芽形成萌芽管穿透蟲體的角質層，利用線蟲體內的營養物質形成菌絲最終充滿線蟲全身，導致線蟲死亡，最終釋放大量孢子[43]。穿刺芽孢桿菌感染的線蟲種群的運動能力明顯下降，在其感染后期只存在角質層，沒有表皮細胞[44]，這意味著線蟲實際上已經接近死亡。

雌性線蟲產下的蟲卵表面附著一種膠狀基質，堅強芽孢桿菌Bacillus firmus可粘附在卵殼上，利用這種基質中的膠原和糖蛋白分子在卵殼表面產生生物膜，并侵入到卵的內部進行定殖，同時引起卵殼糜爛，使蟲卵不能正常孵化[45]。有研究認為，堅強芽孢桿菌除了可以顯著降低卵的孵化率，還可降低線蟲幼蟲的運動能力，其產生的次生代謝產物與線蟲的麻痹和死亡有密切關系[46-47]。

盡管尚未有研究表明此類細菌在松材線蟲上的作用機制，但是有研究表明堅強芽孢桿菌與松材線蟲具有種間互作基礎[48]，該種作用方式仍可能適用于松材線蟲防治。

1.5 細菌動員真菌捕食線蟲 具有捕食線蟲能力的真菌在感受到宿主線蟲后，開始由腐生向寄生生活轉變以適應對宿主的侵染。真菌捕食器官的產生標志著生存策略的轉變。當環境中缺乏合成真菌細胞壁蛋白的氮源，捕食線蟲真菌會產生三維菌絲網，來捕捉環境中的線蟲。當環境中無毒的嗜麥芽寡養單胞菌Stenotrophomonas maltophilia感受到線蟲分泌的信號后，通過釋放尿素激活真菌的生存策略轉化開關，產生捕食器官幫助其消滅線蟲[49-50]。如果環境中存在能夠產生硝酸鹽和酵母浸出物的細菌，可以誘導激活捕食線蟲真菌Arthrobotrys oligospora捕食器官的產生[51]。

2020年從中國浙江省采集的515個松材線蟲病樣品中分離得到此類真菌[52]，為真菌捕食線蟲的研究提供了信息，并為今后對松材線蟲的生物防治提供了重要依據。

2 生防細菌在松材線蟲病防控中的應用

生防菌劑主要通過預防病害的發生來減少植物發病率，有助于減少化學污染，保持生態平衡。因此，利用生物防治措施控制松材線蟲及其媒介昆蟲越來越受到人們的關注和重視。傳統防治松材線蟲病一般從寄主松樹、媒介天牛、病原線蟲上著手，主要方法有及時檢疫、局部范圍內徹底清除、設立隔離帶等[53-54]，但是有環境污染、抗藥性、耗費巨大的人力物力財力等問題。

殺線蟲生防細菌制劑已經有極為成熟的商品，而且應用歷史悠久，以抑制植物寄生線蟲為主，控制線蟲的數量及種群繁衍。Econem生物農藥是拜耳作物科學公司以穿刺芽孢桿菌為主要原材料研制而成的生防制劑，針對多種線蟲具有防治作用，目前已經在多國應用[55]，美國的Gustafson LLC生產的芽胞桿菌菌劑能控制番茄，甜椒和草莓上的植物寄生線蟲[56]，以色列使用的另一種芽胞桿菌制劑Bio-Nem用于控制根結線蟲以及其他線蟲[57]，關于其能否對松材線蟲產生作用，還有待研究。

防治松材線蟲病的生物農藥以微生物活體農藥和微生物代謝產物農藥為主。由毒素致死型蘇云金芽胞桿菌JCK-1233開發獲得的菌劑，已通過空中噴灑用于控制松材線蟲病[58]；能消解線蟲的體表組織的嗜麥芽寡養單胞菌Smal-007已被開發為生物防治菌劑用以防治松材線蟲病，該菌致病定殖能力強、對環境安全無毒，在安徽、福建等地已經取得了良好的防控效果[59]；大腸桿菌產生的代謝產物紫羅蘭素5-O-葡糖苷，對松材線蟲有致死活性，已工業化生產[60]。目前干擾線蟲行為模式以及細菌動員真菌捕食線蟲兩類還沒有被商業開發，可作為復合菌劑中輔助高效殺線菌株的成分，以增加復合菌劑的穩定性。

就生防效果而言，菌劑對其卵以及幼蟲均有殺傷作用的效果要好于專門對成蟲具有殺線活性的菌劑。對植物而言，線蟲生長的速度越快，種群數量越大，其能造成的破壞和殺傷力也就越大。所以從早期進行生物防治也顯得格外重要。細菌生防制劑的開發能夠有效克服傳統防治方法帶來的弊端，但現在細菌致死松材線蟲機理沒有研究透徹，雖然已經有一些生防細菌制劑應用于小規模的林間試驗，但距商品化生產還有很大差距。隨著研究不斷深入，研究方法不斷改進，松材線蟲生物防治必將取得長足發展和輝煌成就。

3 討論與展望

3.1 細菌殺松材線蟲與其他線蟲的差異 秀麗隱桿線蟲是一種在土壤中自由生活的線蟲，具有成本低廉、全身透明易于觀察、生命周期短、基因組全序列已知且容量小、可操控性強等諸多優點，是研究線蟲的模式生物。病原菌糞腸球菌Enterococcus faecalis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae等對于線蟲成蟲有致死作用[61]，但是由于是病原菌無法成為松材線蟲的生防細菌。

植物寄生線蟲的生活方式比較特殊，如根結線蟲，除2齡幼蟲外大部分生活周期都在植物根內完成[62]。因此，殺根結線蟲的細菌菌株對植株根系親和力強，但對在傳播載體中寄生的松材線蟲作用不大。大豆內生細菌與大豆之間的相容關系具有天然優越性，同時不受外界環境的影響，易于定殖，因而對大豆胞囊線蟲病害可能發揮更好的防治效果[63]。關于其他殺線細菌對松材線蟲的作用機制還有待于進一步研究。

殺線細菌具有的毒素致死、消解線蟲體表組織、干擾線蟲的行為模式特點均能夠對松材線蟲致死，捕食線蟲的細菌和細菌動員真菌捕食線蟲兩種作用方式對殺松材線蟲也有較大潛力。

3.2 細菌殺線蟲的作用機制不清晰 上述5種殺松材線蟲機制較為清楚，但還有一些殺松材線蟲的機制并不十分清楚，例如擬南芥拉爾特氏菌Raoultella ornithinolyticaMG通過分泌次級代謝產物致死線蟲，這些毒素因子是非蛋白類的，研究表明酯類化合物以及巴比妥酸類似物對松材線蟲具有致死活性[64-65]，但沒有詳細研究說明具體是破壞了松材線蟲的哪些基本代謝途徑。芽胞桿菌B16會散發出7種吸引線蟲的揮發性有機化合物(VOC)，這些化合物能刺激線蟲的腸道[66]，后續研究還發現其分泌的蛋白酶能消解線蟲的體表組織[33]。干擾線蟲行為模式的細菌產生的化合物能夠干擾線蟲的正常生理活動，但是在線蟲的結構組成及神經元受體的信號通路方面沒有過多的研究。

捕食線蟲的細菌和細菌動員真菌捕食線蟲的種間互作機制對環境的要求較高。捕食線蟲的細菌往往是在環境中通過營養交換來削弱線蟲的抗逆能力再進一步殺死線蟲，但環境的作用可能會使線蟲進入具有抗逆能力的擴散期，從而很難達到預期效果。毒素致死、消解線蟲體表組織和干擾線蟲的行為模式已經確定具有殺死松材線蟲的作用，捕食線蟲的細菌和細菌動員真菌捕食線蟲兩種作用方式具有殺死松材線蟲的潛力，但這些作用方式可能不是單一的，這在已經研究過的其他線蟲身上已有證實。

銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa通過多種方式致死線蟲，它的鐵載體既潛在地促進植物的生長并保護植物，又能與線蟲搶奪環境中的鐵離子，打破線蟲體內鐵平衡，而產生的生物膜又能夠干擾線蟲正常的生長活動[67]。綜上所述，細菌能夠致死線蟲的作用方式并非是單一一種，可能是通過復雜的、復合的作用方式致死，但是在細菌與線蟲的種間互作中這些機制尚未研究透徹。

3.3 殺線菌劑廣泛應用遇到的問題 對于需要工廠化生產的生防菌劑而言，明確菌株的作用機制至關重要，將有助于實現經濟效益最大化，減少工廠的生產成本，優化生產工藝流程。

松材線蟲生防科研成果用于工業化生產，除在篩選拮抗細菌、代謝物的分離和提純等方面做大量工作外，殺線蟲的作用機制、生防菌劑的增效和復配以及對環境的影響等是需要解決的問題。細菌產生的代謝產物能應用于生產的一般都是次級代謝產物，在發酵培養基的選擇上有著很大困難，既要適合菌體的生長，又需要一定的環境刺激使其產生次級代謝產物。一般而言，活性物質和毒素大都在有機物中，這給實際應用帶來了困難。通常可以通過添加增效劑來助溶，更為合理的是通過對其結構進行必要的化學修飾，在增大溶解性的同時也增強其對線蟲的作用，這些工作都有待進行。研究結果表明，生防菌劑混合施用對植物寄生線蟲的防治有著光明的前景，需要深入研究復配菌劑。生防菌劑防效不穩定性限制了其商業發展，其不穩定因素主要是生防菌之間的互作在根部或土壤中定殖程度不同[68]，所以混合菌劑的開發利用有著廣泛的應用前景。

上述5種作用方式均具有開發為生防菌劑的潛力，生防菌劑穩定的防效不僅需要深入研究殺松材線蟲的作用機制，還需要科學的根據作用機制復配混合菌劑，這對松材線蟲病生防菌劑的開發提供了技術保障。

3.4 展望 以上類型的研究結果與理論知識，揭示了生防細菌利用種間互作增強防病效果的機制，將為控制松材線蟲病的蔓延和減輕發病程度提供新思路，也不斷為高效生防菌劑的開發提供重要的理論依據?；趯ΜF有研究結果和理論知識的理解與分析，今后的細菌防治松材線蟲研究與應用中需重點關注以下幾點：

1)深入研究細菌殺松材線蟲的作用機制。在研究5種殺線細菌的作用方式上，今后可通過驗證文中提及的作用機制，對殺線菌株增強松材線蟲病防病效果的機理，特別是分子機理進行深入研究。應特別關注毒素致死，消解線蟲體表組織中對線蟲的結構性蛋白，基礎代謝上的研究。干擾線蟲的行為模式類型在線蟲的結構組成及神經元受體的信號通路方面沒有過多的研究，對于分子間的互作研究方面更是寥寥無幾。捕食線蟲的細菌和能動員真菌捕食線蟲的細菌在其他線蟲上的研究基礎應該在松材線蟲上進行試驗，以驗證其猜想。深入研究細菌殺松材線蟲的作用機制，有利于松材線蟲病的防控。

2)利用現代分子生物學技術推動生防菌劑開發。對于毒素致死型殺線細菌，利用基因工程技術可以將產毒素的基因轉入到工程菌株中，簡化毒素的分子結構，使其能更加穩定有效地作用于線蟲靶標。想要提取能夠消解線蟲體表與組織的蛋白酶，由于其酶所具有的特性，容易變性和失活，利用酶工程加強蛋白酶的穩定性是研究的重中之重。如果研究針對殺線細菌產生的化合物干擾線蟲的行為模式，可能需要將物質與線蟲、物質與細菌分別研究其作用機制，不應局限于細菌產生物質的分離和鑒定，細菌產生該化合物的條件、生物信息學中的轉錄組分析更能幫助此類殺線機制的研究。

相較于其他種類殺線細菌，捕食線蟲的細菌作用效果慢、時間長，用遺傳學進行改良，更快更高效地殺死線蟲也是應該突破的難點。如果利用環境生物技術，系統生物學，直接將細菌動員真菌捕食線蟲產生的物質添加到環境中，就可以提前預防松材線蟲的侵蝕。

利用現代分子生物學技術開展相關研究，可有效解決細菌殺線機制研究與生防菌劑作用開發上的局限性，深刻揭示微生物與松材線蟲的互作機制，奠定生物學基礎的同時促進生防菌劑的開發與應用。

3)生防菌劑混合施用。施用復合菌劑能解決殺線菌劑廣泛應用的局限。細菌與線蟲相互作用的重要分子機制及其調控方式，可以為構建高效的殺線蟲工程菌株和復配更加高效的生防菌劑提供線索。

最早進行田間應用嗜麥芽寡養單胞菌Smal-007由于其菌株不產胞的特性，工廠化生產較為困難。廣為熟知的蘇云芽胞桿菌的殺線機理雖然已經研究的較為透徹，但由于其對多數病原菌都有抑菌活性，應用較為廣泛，并且長期單一使用一種菌株，會導致耐藥性，多效復合的生物防治策略能夠有效地解決這些問題。以毒素致死型、消解線蟲體表組織兩種類型為主，構建高效的殺線蟲工程菌株，以干擾線蟲行為模式、細菌捕食線蟲以及細菌動員真菌捕食細菌等為輔，復配更加高效的生防菌劑，多靶點多方向的作用方式，不僅能穩定菌劑的作用效果，而且能對不同生長階段的線蟲均有致死作用。研究結果表明，生防菌劑防效的不穩定性限制了其商業發展，因此，在林業病害防控壓力較大的現狀下，將高效的殺線菌株搭配施用，便于在短時間內實現生防制劑的大面積覆蓋，有效遏制松材線蟲病擴散蔓延，有助于推動林業可持續發展。