昆明滇潤楠葉緣枯病病原鑒定及生防菌篩選

魏玉倩陳健鑫唐婕孫會林黃培珊伍建榕

(1.西南林業大學云南省高校森林災害預警控制重點實驗室，云南昆明 650224；2.西南林業大學國家林業和草原局西南地區生物多樣性保育重點實驗室，云南昆明 650224；3.會澤縣者海林場，云南會澤 654200)

滇潤楠Machilus yunnanensis為樟科Lauraceae潤楠屬Machilus的常綠喬木，主要分布在云南中部、西部至西北部，四川西南部和西部等地區[1]，因其樹齡長、生長快、樹形美，能抵抗環境污染等特性，已列為昆明市園林規劃中采用的鄉土樹種之一[2]。由于大面積綠化種植，近年來，滇潤楠葉緣枯病發生日趨嚴重，削弱樹勢，影響城市景觀。目前對滇潤楠的研究主要集中在組織培養[3]、光合速率[4]、苗木培育技術[5]等方面，未見對滇潤楠葉緣枯病的研究報道。該病主要危害葉片，從葉尖及葉緣開始發病，病斑圓形至橢圓形，中部灰褐色，邊緣褐色，后期病斑上散生黑褐色小點即病原菌的分生孢子盤。該病主要引起葉尖或葉緣變褐壞死或干枯，導致大量落葉影響觀賞。筆者以昆明地區及西南林業大學校園滇潤楠葉緣枯病的病害調查為切入點，通過形態學和分子生物學鑒定相結合的方法對滇潤楠葉緣枯病進行病原鑒定，并通過柯赫氏法則進行致病性測定的驗證，確定引起該病害的病原菌，同時進行病原生防菌的篩選。該研究屬國內首次報道，以期為城市綠化樹種滇潤楠葉緣枯病的綠色防控提供新思路。

1 材料與方法

1.1 調查地概況 昆明位于云貴高原中部，滇池盆地北部，海拔1 800～4 200 m，屬北緯低緯度亞熱帶-高原山地季風氣候，年平均氣溫15℃，年降水量1 040 mm左右。昆明市區及西南林業大學校園內滇潤楠樹齡為20 a，樹高4.5～5.0 m，冠幅約為3.0 m×3.0 m。

1.2 試驗材料 試劑：2×Taq Maseter Mix購自近岸蛋白質科技有限公司；HP Fungal DNA Kit試劑盒、DM 2000 plus Marker、通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′)均購自昆明碩陽科技有限公司；凝膠(1×TAE 23 mL、瓊脂糖0.23 g、4s Green 2.3 μL)。

儀器：低溫高速離心機 Eppendorf(5811ZJ44568)，昆明倍捷科技有限公司；格蘭特XB70-FZ雪花形制冰機，寧波格蘭特制冷設備制造有限公司；ZWY-200D恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；846-X-070-101梯度PCR儀，Biometra GmbH；721BR13670凝膠成像儀，Bio-RAD。

菌株：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、膠質類芽孢桿菌Paenibacillus mucilaginosus和多粘芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa均由西南林業大學森林病理學實驗室提供。

1.3 滇潤楠葉緣枯病發病情況調查及標本采集2018年3月至2020年3月，采用普查和專題調查相結合的方法對昆明地區及西南林業大學校園等9個滇潤楠行道樹種植區發生嚴重的滇潤楠葉緣枯病進行了發病率及危害程度調查，昆明地區的8個調查地點采用五點法，每點調查30株，西南林業大學校園內共調查100株。觀察記錄病害的發病特點，并拍照記錄。根據病害分級標準(表1)計算病情指數。同時，采集具有典型葉緣枯病癥狀的病害葉片標本帶回實驗室進行病原形態鑒定及分離培養。病情指數=100×∑(各級病葉數×各級代表值)/(調查總葉數×最高級代表值)。

表1 滇潤楠葉緣枯病分級標準Tab.1 Classification standard for leaf spot of M.yunnanensis

1.4 病原菌分離與致病性測定

1.4.1 病原菌的分離培養與純化 采用組織分離法對滇潤楠病葉上的病原菌進行分離。病健交界處切取病組織4～5 mm的小塊，置于75%乙醇中浸泡10 s，移入0.1%氯化汞溶液中浸泡3～5 min，再轉移到無菌水中漂洗3遍，最后置于PDA培養基上，25℃培養箱中培養，待長出菌絲后，挑取少量菌絲移到PDA平板上，25℃培養箱中進行純化培養，觀察并記錄病原菌形態特征[6]。

1.4.2 致病性測定 根據柯赫氏法則采用傷口接種測定致病性，將健康葉片用75%乙醇進行表面消毒，用滅菌針輕微刺傷或燙傷葉片表皮，然后用打孔器打取菌絲塊貼于接種處，置于滅菌塑料袋內于培養箱內25℃恒溫保濕培養，以不接菌為對照，定期及時觀察發病情況，發病后重新分離病原菌，如與接種前病原菌形態相同即可確定為病原菌[7]。

1.5 病原菌鑒定

1.5.1 形態學鑒定挑取葉緣枯病癥狀上的病原菌子實體(褐色小點)進行徒手切片鏡檢，觀察病原菌的形態特征；如果病葉未產生子實體，將病部用無菌水保濕培養24～72 h，待子實體成熟產孢后再進行切片鏡檢，觀察病原菌的孢子形態和產孢結構[8-9]；并顯微拍照。根據病原菌形態、大小，查閱相關資料進行病原鑒定[10-11]。

1.5.2 分子生物學鑒定

1.5.2.1 DNA提取 將分離純化的病原菌菌株轉到PDA培養基上培養7 d，選用HP Fungal DNA Kit試劑盒提取基因組DNA。

1.5.2.2 PCR擴增 采用通用引物ITS1和ITS4；PCR 反應體系：Mix，25 μL；ddH2O，20 μL；ITS1，1.5 μL；ITS4，1.5 μL；DNA，2.0 μL。 PCR 反應條件：94 ℃，3min；94 ℃，30 s；56 ℃，40 s；72 ℃，50 s；72℃，10 min；30次循環。PCR擴增產物經凝膠電泳檢測后送至擎科生物系統有限公司進行測序。

1.5.2.3 rDNA-ITS序列及系統發育分析 滇潤楠葉緣枯病菌分離物測序獲得rDNA-ITS序列，用生物信息學軟件BioEdit和Clustalx進行拼接，人工校對，編輯后獲得準確序列提交NCBI下載與該病原菌的rDNA-ITS序列進行分析，采用PAUP4進行系統發育分析，用NJ(neijhbor-joining，鄰接)算法，1 000次重復構建系統發育樹。

1.6 篩選對滇潤楠葉緣枯病有抑菌效果的生防菌

1.6.1 芽孢桿菌菌液制備 首先活化由西南林業大學森林病理學實驗室提供的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、膠質類芽孢桿菌Paenibacillus mucilaginosus和多粘芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa，然后進行擴繁。枯草芽孢桿菌、膠質類芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌菌株均在LB斜面上活化24 h，配成1×108cfu/mL的菌懸液，取500 μL接入裝有50 mL LB培養液的三角瓶中，28℃，180 r/min振蕩培養120 h，制備成濃度為1×108cfu/mL的菌液。

1.6.2 病原菌孢子懸浮液制備 將滇潤楠葉緣枯病病原菌活化3 d后，在PDA平板上生長7 d，用挑針輕刮子實體，再用無菌去離子水使孢子懸浮，并通過4層紗布過濾到250 mL三角瓶中，用無菌去離子水稀釋，血球計數板計數，將分生孢子濃度調整為1×105個/mL。

1.6.3 抑菌效果檢測 選擇健康的滇潤楠葉片，70%乙醇表面消毒，用滅菌的針刺或燙傷，造成微傷口，接種設置3個抑菌處理和1個對照處理。①接種1×108cfu/mL枯草芽孢桿菌B.subtilis溶液20 μL和1×105個/mL滇潤楠炭疽菌孢子懸浮液20 μL；②接種 1×108cfu/mL膠質類芽孢桿菌P.mucilaginosus(G-51)溶液 20 μL 和 1×105個/mL滇潤楠炭疽菌孢子懸浮液20 μL；③接種1×108cfu/mL多粘芽孢桿菌P.polymyxa(BYEC2)溶液20 μL和1×105個/mL滇潤楠炭疽菌孢子懸浮液20 μL；④接種蒸餾水20 μL和 1 ×105個/mL滇潤楠炭疽菌孢子懸浮液20 μL。每處理l0片葉片，重復3次。計算發病率，測量病斑直徑并計算各處理的抑菌效果，觀察分生孢子盤的發育情況和計算分生孢子盤發育指數。分生孢子盤發育分級標準：0級，未形成分生孢子盤；I級，出現黑色分生孢子盤；Ⅱ級，分生孢子盤顏色加深，但不成輪紋狀排列；Ⅲ級，出現深褐色分生孢子盤且成輪紋狀排列。

發病率(%)=發病葉數/接種總葉片數×100

分生孢子盤發育指數=100×∑(各級分生孢子盤數×各級代表值)/(鏡檢總分生孢子盤數×最高級代表值)

抑菌效果(%)=(對照組病斑直徑-抑菌組病斑直徑)/對照組病斑直徑×100

1.6.4 數據統計 病原菌的抑菌效果采用DPS軟件Duncan氏多重極差檢驗法，進行差異顯著性分析[12-14]。

2 結果與分析

2.1 滇潤楠葉緣枯病發病情況 昆明市區滇潤楠行道樹8個地點的行道樹各150株樹平均有102株受到葉緣枯病危害，發病率68%，病情指數均達到47.4；西南林業大學校園100株滇潤楠有69株受到葉緣枯病危害，發病率69%，病情指數均達到46.7。該病主要危害葉緣及葉尖，發病初期先在葉尖或葉緣出現淺褐色病斑，隨著病情的發展，病斑逐漸擴大，形成灰褐色病斑，葉斑從外向內逐漸干枯，發病后期在病斑上出現黑色小顆粒(子實體，分生孢子盤)，后期葉片變黃枯死，導致大量落葉(圖1)。

圖1 滇潤楠葉緣枯病發病癥狀Fig.1 Symptom of leaf margin blight of M.yunnanensis

2.2 病原菌分離與致病性測定結果

2.2.1 病原菌分離 分離菌株在PDA培養基上培養性狀表現為菌落圓形，5 d觀察到菌落白色，菌落邊緣排列整齊，7 d菌絲輻射狀生長，顏色變灰白色(圖2)。

圖2 滇潤楠葉緣枯病病原菌在PDA培養基上菌落形態及顏色Fig.2 Colony morphology and color of leaf margin blight pathogen of M.yunnanensis on PDA medium

2.2.2 致病性測定 分離純化的病原菌接種到經針刺或燙傷處理葉片后，葉片均發病，而清水對照葉片不發病。接種7 d后在接種部位產生褐色圓斑，12 d后圓斑逐漸擴大，并產生黑色小點，接種導致葉片尖端變枯，與自然發病癥狀相同。對接種獲得的病葉進行重分離培養后，獲得相同的病原菌，說明該菌是滇潤楠葉緣枯病的致病菌(圖3)。

圖3 滇潤楠葉緣枯病離體接種癥狀Fig.3 Symptoms of leaf margin blight of M.yunnanensis after in vitro inoculation

2.3 病原菌鑒定結果

2.3.1 形態學鑒定 自然條件下發病的病斑通過徒手切片觀察，顯示分生孢子盤褐色，有剛毛；分生孢子梗細長柱形、長筒形，無色、無隔膜，大小為(16.8～18.2)μm ×(3.9～5.4)μm；分生孢子圓柱形，兩端鈍圓，單孢，大小為(10.9～15.6)μm×(2.8～4.2)μm。經分離純化得到的病菌與切片得到的病原菌相同。初步確認引起滇潤楠葉緣枯病的病原為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides(Penz.)Penz.＆Sacc.(圖4)。

圖4 膠孢炭疽菌C.gloeosporioides分生孢子盤、孢子及剛毛Fig.4 Acervulus，conidium and seta of C.gloeosporioides

2.3.2 分子生物學鑒定 擴增病原菌ITS-rDNA基因，得到573～577 bp的DNA片段。序列測定并比對結果表明，供試菌株(DRN)基因組ITS-rDNA序列與NCBI庫內的炭疽病菌 (GenBank登錄號為KC010549.1)同源性達到了100%，據此確認致病菌為Colletotrichum gloeosporioides。同時采用貝葉斯分析方法所構建的炭疽菌屬Colletotrichum和其近緣類群的系統發育樹揭示其分類地位(圖5)。

圖5 采用PAUP4所構建的病原菌菌株DRN和其近緣類群的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of DRN pathogen and its related groups constructed by PAUP4

2.4 生防菌對滇潤楠葉緣枯病菌抑菌效果 經枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、膠質類芽孢桿菌Paenibacillus mucilaginosus和多粘芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa處理，3個菌株對滇潤楠葉緣枯病原菌的抑菌效果與對照之間都達到顯著性差異，其中枯草芽孢桿菌處理18 d后，滇潤楠葉片發病率為25.66%、病斑直徑為 0.68 cm、抑菌效果為84.92%，分生孢子盤發育指數為0.12，達極顯著水平(P＜0.01)，抑菌效果最好；其次是膠質類芽孢桿菌，再次是多粘芽孢桿菌(表2)。

表2 接種18 d后3種芽孢桿菌對滇潤楠葉緣枯病病原菌的抑菌效果Tab.2 Antifungal effect of Bacillus spp.against leaf margin blight pathogen on M.yunnanensis 18 days after inoculation

3 討論

因滇潤楠抗旱及抗寒性好，昆明市現已將原來的綠化行道樹種銀樺Grevillea robusta和小葉榕Ficus concinna更換為滇潤楠，可見滇潤楠在昆明市綠化中起到舉足輕重的作用。目前，僅見關于滇潤楠組織培養及快速培養技術，育苗造林技術以及滇潤楠上害蟲長脊冠網蝽Stephanitis svensoni的防治[15]等方面的報道，而本次對滇潤楠葉緣枯病的研究屬首次報道。傳統真菌學系統分類是以形態學特征及孢子形態為主要依據，尤其是將產孢結構等用作分類鑒定的主要性狀，并遵循柯赫氏法則進行鑒定。

本試驗中，通過野外調查，樣本采集，將分離培養、回接、重新分離獲得的病原菌經顯微觀察，形態學與分子生物學鑒定相結合，確定了引起滇潤楠葉緣枯病的致病菌為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。在一定程度上克服了僅以形態學為基礎的分類系統的人為和環境條件影響，從更深層面進行分析研究，兩種方法的結果得到相互印證，保證了研究結果的可靠性。滇潤楠葉緣枯病病原菌經鑒定為半知菌類腔孢綱黑盤孢目黑盤孢科炭疽菌屬的膠孢炭疽菌C.gloeosporioides，與王柏泉 等[16]報道的樟樹炭疽病病原菌一致。

3種芽孢桿菌處理離體葉片對病原菌的抑菌試驗表明：枯草芽孢桿菌、膠質類芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌均可抑制滇潤楠葉緣枯病原菌，特別是枯草芽孢桿菌對引起滇潤楠葉緣枯病的炭疽菌的抑菌效果最佳，達到極顯著性差異，抑制了病斑的擴展和分生孢子盤的發育，但枯草芽孢桿菌對滇潤楠葉緣枯炭疽病的生防機理尚不清楚，因而還需要深入研究枯草芽孢桿菌的生防機理，找到有效的預防和早期治療措施。