蒙古黃芪病程相關蛋白AmPR-10于大腸桿菌不同載體的可溶性表達策略研究

王玨, 胡麗麗, 李桂蘭, 吳娜, 張育敏

山西中醫藥大學基礎醫學院, 山西 晉中 030600

植物病程相關蛋白(pathogenesis-related proteins, PR)是植物體被病原體侵害及受到外界壓力時產生的[1]。這些PR蛋白主要被劃分為17個家族，具有廣泛的功能[2]，其中PR-10不僅僅參與植物的抗病機制反應，同時在其自身發育中也起作用[3]。有文獻指出蒙古黃芪病程相關蛋白AmPR-10由158個氨基酸組成，理論大小為16.8 kD，且具有核酸酶活性[4-5]。并有研究證明，PR-10類蛋白的核酸酶活性可能在植物防御病原體感染中起作用，和其抗RNA類病毒相關[6]。因此體外研究AmPR-10的性能對深入探討黃芪抗病機制具有重要意義，然而從天然黃芪中提取蛋白質的傳統方法成本較高，蛋白得率較少，后續研究不便。

大腸桿菌表達體系遺傳背景清楚、操作簡便，對外源基因表達研究是一條高效、經濟的途徑[7]，但因其缺少蛋白質表達后的修飾體系，使來源于真核生物的外源基因表達后不能正確折疊，常以不溶的包涵體形式存在[8]。針對這一現象，目前有多種方式可提高外源基因的可溶性表達量，如與標簽融合表達[9-10]、分子伴侶修飾表達[11-13]、提高周質蛋白表達[14]或更換宿主菌等[15-16]。本研究試圖建立AmPR-10基因在大腸桿菌內的可溶性表達體系，選擇融合標簽以及分子伴侶修飾的方法以期高效表達具有活性的蒙古黃芪病程相關蛋白，為進一步探索AmPR-10核酸酶活性機制，研究蒙古黃芪生長發育抗病過程提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料 蒙古黃芪葉片(山西中醫藥大學種植)；大腸桿菌k12購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；感受態大腸桿菌EscherichiacoliBL21購于生工生物工程(上海)有限公司；克隆表達載體pET-28a、pET-30a由山西中醫藥大學基礎醫學院實驗中心提供。

1.1.2實驗試劑TaqDNA聚合酶、限制性內切酶NcoⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、細菌基因組提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、質粒提取試劑盒、凝膠純化試劑盒、Ni2+純化蛋白試劑盒、酵母tRNA等均購于生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.3實驗儀器 PCR儀購自杭州科學儀器有限公司；凝膠成像系統購自北京六一生物科技有限公司；高速冷凍離心機購自湖南湘立科學儀器有限公司；恒溫搖床購自上海博訊實業有限公司；超聲破碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 重組子構建

1.2.1蒙古黃芪總RNA提取 稱取蒙古黃芪葉片0.2 g，在冰上研磨，轉移至離心管。加入Trizol試劑室溫放置5 min。加入氯仿和異丙醇離心抽提，室溫晾干加入緩沖液溶解RNA。

1.2.2目的基因PCR 以蒙古黃芪總RNA為模板，利用RT-PCR試劑盒，得到AmPR-10的擴增產物。反應體系(共50 μL)為：模板RNA 15.5 μL，緩沖液5 μL，上、下游引物各2 μL，反轉錄酶混合物0.5 μL, RNA酶抑制劑0.5 μL,TaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 24 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環；72 ℃充分延伸5 min。提取大腸桿菌k12基因組，以其為模板，通過PCR得到skp的擴增產物，反應體系(共50 μL)為：模板2 μL，上、下游引物各2.5 μL，TaqDNA Mix 25 μL, ddH2O 18 μL。反應程序同上。引物設計以NCBI公布的基因序列為模板(AmPR-10 Gene ID: KY419098.1，skpGene ID: 000913.3)，見表1所示。

1.2.3目的基因克隆 使用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對AmPR-10基因擴增產物酶切，將得到的酶切產物割膠純化后，與使用相同限制性內切酶酶切的載體pET28a與pET30a分別連接，轉化宿主BL21(DE3)，得到重組子pET28a-AmPR-10和pET30a-AmPR-10；使用限制性內切酶NcoⅠ和EcoRⅠ對重組子pET30a-AmPR-10質粒酶切，將產物與經相同限制性內切酶處理后的分子伴侶skp相連接，轉化宿主BL21(DE3)，得到重組子pET30a-skp-AmPR-10(分子伴侶skp位于目的基因AmPR-10上游)。

1.3 目的蛋白表達和純化

將重組子于LB液體培養基中培養，轉速為200 r·min-1，至菌體濃度OD600達到0.5～0.6時加入IPTG誘導(IPTG終濃度達0.1 mmol·L-1)，于37 ℃培養4 h及16 ℃培養12～16 h誘導蛋白表達。通過超聲破碎獲得目標蛋白的粗蛋白液(溶于Tris-HCl緩沖液中)，然后通過Ni2+蛋白純化試劑盒純化目標蛋白，并用SDS-PAGE檢測純化前后的蛋白樣品，確定正確表達。通過考馬斯亮藍法測定純蛋白的濃度。

表1 用于目的基因PCR的引物序列Table 1 The primers for gene cloning

1.4 目的蛋白活性檢測

稱取2 mg酵母tRNA溶于1 mL緩沖液( 100 mmol·L-1MES，pH 6.0)中，加入100 μL含有目標蛋白AmPR-10的上清液，50 ℃保溫30 min。反應完成后立即加入1 mL預冷的氯化鋰終止反應，冰浴3 h，12 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，取上清液于260 nm處測定其吸光度，以未加酶液的樣品為對照。酶活定義為在50 ℃、pH 6.0反應條件，2 mL反應體系中，在30 min內使A260吸收值變化1.0的酶量定義為一個活性單位U(活性定義參照上海翊圣生物科技有限公司Benzonase Nuclease全能核酸酶使用說明書)。

1.5 目的蛋白結構模擬分析

對目的蛋白AmPR-10(單獨表達)、S-tag+AmPR-10(與標簽融合表達)、skp+S-tag+AmPR-10(標簽基礎上，通過分子伴侶修飾表達)分別進行SWISS-MODE建模(http://swissmodel.expasy.org/)，獲得PDB文件。使用軟件SOPMA對目的蛋白進行二級結構分析，使用軟件Chimera對目的蛋白空間三級結構進行局部分析。

2 結果與分析

2.1 重組子的克隆

本研究選擇利用表達載體pET-28a與pET-30a構建重組子pET28a-AmPR-10與pET30a-AmPR-10；選擇利用分子伴侶skp對重組子pET30a-AmPR-10中的外源基因進行修飾，構建重組子pET30a-skp-AmPR-10，以建立AmPR-10在大腸桿菌中的可溶性表達體系。

2.1.1目的基因PCR 如圖1所示，以大腸桿菌k12基因組為模板，通過PCR得到分子伴侶skp，長度為483 bp(條帶1、條帶2)，符合預期大小；以蒙古黃芪葉片總RNA為模板，通過RT-PCR得到目的基因AmPR-10，長度為474 bp(條帶3、條帶4)，符合預期大小。

注：M—Marker；1、2—分子伴侶skp擴增結果；3、4—目的基因AmPR-10擴增結果。圖1 目的基因AmPR-10和分子伴侶skp的PCR結果Fig.1 The PCR result for target gene AmPR-10 and molecular chaperone skp

2.1.2重組子鑒定 圖2A為重組子pET28a-AmPR-10的鑒定結果，重組子經EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后電泳有2條條帶，分別與對照位置相同，確定得到陽性克隆；圖2B為重組子pET30a-AmPR-10的鑒定結果，重組子經EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后電泳有2條條帶，分別與對照位置相同，確定得到陽性克隆。

注：A：重組子pET28a-AmPR-10鑒定結果，M—Marker；1—AmPR-10的PCR結果；2—質粒pET28a鑒定結果；3—重組子pET28a-AmPR-10雙酶切鑒定結果；B：重組子pET30a-AmPR-10鑒定結果，1—AmPR-10的PCR結果；2—質粒pET30a鑒定結果；3—重組子pET30a-AmPR-10雙酶切鑒定結果。圖2 重組子鑒定結果Fig.2 Identification of the recombinants

如圖3所示，以重組質粒pET30a-skp-AmPR-10為模板，對目的基因進行PCR擴增。條帶1、2為平行樣品，是對skp和AmPR-10構成的全基因進行PCR的鑒定結果，全長為957 bp，條帶位置符合預期大小；另將重組基因進行測序，成功鑒定重組子。

注：M—Marker；1、2—skp與AmPR-10全基因PCR鑒定結果；3—skp PCR鑒定結果；4—AmPR-10 PCR鑒定結果。圖3 重組子pET30a-skp-AmPR-10鑒定結果Fig.3 Identification of the recombinant pET30a-skp-AmPR-10

2.2 目的蛋白表達

通過比較重組子pET28a-AmPR-10和pET30a-AmPR-10的目的基因表達量，可分析標簽S-tag在外源基因表達中的作用；根據重組子pET30a-skp-AmPR-10中目的基因可溶性表達量的變化，探討分子伴侶skp在外源基因表達中的作用。

圖4中，條帶1、2、3為pET28a-AmPR-10 蛋白表達情況，位置在17 kD附近，與文獻報道AmPR-10蛋白大小一致(16.8 kD)[5]，但可溶性表達量并不樂觀，大部分蛋白質以包涵體形式存在(條帶3)；條帶4、5、6為pET30a-AmPR-10的表達情況，與前者相比，在相同條件下目的蛋白可溶性表達量有所提高，同時包涵體蛋白減少(條帶6)，因載體pET30a有S-tag標簽修飾，故蛋白條帶位置高于前者，大小約為19 kD。

注：M—Marker；1、2—重組子pET28a-AmPR-10于37、16 ℃誘導可溶性蛋白表達結果；3—重組子pET28a-AmPR-10于16 ℃誘導包涵體蛋白表達結果；4、5—重組子pET30a-AmPR-10于37、16 ℃誘導可溶性蛋白表達結果；6—重組子pET30a-AmPR-10于16 ℃誘導包涵體蛋白表達結果；7—未誘導對照。圖4 重組子pET28a-AmPR-10與重組子pET30a-AmPR-10蛋白表達結果比較Fig.4 Comparison of protein expression between recombinant pET28a-AmPR-10 and pET30a-AmPR-10

由圖4可確定16 ℃低溫誘導條件下，各重組子的可溶性蛋白表達量更高，故在此條件下，對重組子pET30a-AmPR-10和pET30a-skp-AmPR-10的外源蛋白可溶性表達情況進行比較，如圖5所示，重組子pET30a-skp-AmPR-10的可溶性蛋白表達量進一步提高，蛋白大小在34 kD附近(條帶2)，符合分子伴侶skp與目的基因AmPR-10融合表達的結果。

注：M—Marker；1—未誘導對照；2、3—重組子pET30a-skp-AmPR-10、pET30a-AmPR-10于16 ℃誘導可溶性蛋白表達結果。圖5 重組子pET30a-AmPR-10與重組子pET30a-skp-AmPR-10蛋白表達結果比較Fig.5 Comparison of protein expression between recombinant pET30a-AmPR-10 and pET30a-skp-AmPR-10

2.3 目的蛋白結構模擬分析

2.3.1S-tag對蛋白外源表達的影響 載體pET30a和pET28a的區別是前者含有S-tag標簽，有學者發現源于地衣芽孢桿菌的漆酶N端融合S-tag構建于pET-22b 載體，并轉化大腸桿菌 BL21(DE3)后可顯著提高其在大腸桿菌中的可溶性表達量，大約提高20倍[17]。本研究對S-tag修飾前后的AmPR-10分別進行建模分析，通過chimera軟件分析發現目的蛋白空間構象的變化：①圖6顯示AmPR-10在經S-tag修飾后，第一段α螺旋結構得以延長，增加了2個氨基酸，為39位Val和40位Thr，Val是疏水性氨基酸，Thr是極性氨基酸易形成氫鍵，二者加強了α螺旋的穩定性；②圖7顯示原91位Asp、92位Ala及93位Asn是連接2段β折疊的linker，經S-tag修飾表達后，該部分形成了1段短α螺旋，且Ala為疏水性氨基酸，同樣有利于增強此段α螺旋的穩定性[18]。有文獻表明，α螺旋結構有利于提高蛋白穩定性[19]，因此，重組子pET30a-AmPR-10表達量高于pET28a-AmPR-10，可能是由于載體pET30a上的S-tag與目標蛋白融合，增加了α螺旋結構的比例，由此提高目標蛋白的穩定性，進而提高可溶性表達量。

2.3.2分子伴侶skp對蛋白外源表達的影響

圖8A所示為AmPR-10的三級結構預測圖，通過SOPMA分析，其α螺旋占比約為36.08%；圖8B為skp與AmPR-10融合表達的蛋白質三級結構預測圖，圖中Ⅰ部分表示AmPR-10的三級結構，Ⅱ部分表示skp的三級結構，2個部分由“linker”相連，如圖中虛線所示，且skp與AmPR-10的N末端結合。分子伴侶幫助目標蛋白正確折疊，在天然宿主體內，最后會被切去，并不成為成熟蛋白的一部分。由圖8B顯示，模擬結果符合分子伴侶的定義，skp與AmPR-10各自獨立表達，skp不影響AmPR-10的空間結構。由于在外源大腸桿菌宿主內，缺失切除分子伴侶skp的酶催化系統，因此2個部分以linker連接的方式融合表達，而skp主要由α螺旋結構組成，因此使得由其與AmPR-10共同構成的全蛋白三級結構中α螺旋比例提高，根據軟件計算分析，可達78.87%，進而提高全蛋白的疏水性，使蛋白空間構象更加穩定，實現重組子pET30a-skp-AmPR-10可溶性蛋白表達量提高的目的。

圖6 S-tag修飾前、后39位Val、40位Thr空間構象Fig.6 Spatial conformations of 39 Val and 40Thr before and after the S-tag modification

圖7 S-tag修飾前、后91位Asp、92位Ala、93位Asn空間構象Fig.7 Spatial conformations of 91 Asp 、92 Ala and 93 Asn before and after the S-tag modification

2.4 目的蛋白純化與活性測定

標簽S-tag和分子伴侶skp的修飾可提高AmPR-10在大腸桿菌內的可溶性表達量，為進一步探討融合表達是否對目的蛋白生物活性有影響，研究對3種重組子表達的蛋白進行純化，按照洗脫液(咪唑)濃度分別為62.5、125及250 mmol·L-1進行梯度洗脫，通過SDS-PAGE檢測結果，如圖9所示。

A：AmPR-10三級結構預測模擬圖；B：skp與AmPR-10融合表達圖8 AmPR-10以及skp與AmPR-10融合表達三級結構預測模擬圖Fig.8 The prediction for the 3D structure of AmPR-10 and the fusion protein of skp and AmPR-10

注：M—Marker；1～3—重組子pET28a-AmPR-10表達蛋白純化結果；4～6—重組子pET30a-AmPR-10表達蛋白純化結果；7～9—重組子pET30a-skp-AmPR-10表達蛋白純化結果；洗脫液濃度均依次為62.5、125、250 mmol·L-1。圖9 目標蛋白梯度洗脫結果Fig.9 Gradient elution results of target protein

圖9中顯示洗脫液較高濃度時，目標蛋白純化效果較好。測定各蛋白濃度，檢測出目的蛋白均對酵母tRNA有催化活性，平均值為1.1 U·mg-1，相差不大。說明AmPR-10外源可溶性表達量的提高是以不影響蛋白質生物活性為基礎的。

3 討論

植物病程相關蛋白PR-10是植物體防御體系的重要組成部分，很多蛋白質都已被外源表達，如辣椒病程相關蛋白PR-10體外重組后，可抑制辣椒疫霉菌的菌絲生長[20]；刺茄重組病程相關蛋白PR-10可以抑制稻瘟病菌菌絲的生長[21]；外源表達的三七病程相關蛋白對腐皮鐮刀菌和壞損柱孢菌具有抑制作用[22]；本生煙病程相關蛋白經原核表達后成功進行了抗血清制備[23]等。蒙古黃芪病程相關蛋白AmPR-10具有核酸酶活性，與其抗RNA類病毒相關，因此獲得大量的具有活性的外源蛋白，有利于后期生物性能的相關研究。目前有關AmPR-10的報道還局限于從天然蒙古黃芪中提取，本研究首次建立目標蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達體系，通過更換載體，提高AmPR-10的外源表達量，探討并確定了載體標簽S-tag和分子伴侶skp的生物學功能，利用S-tag和skp的累加效應，實現獲得大量外源可溶性AmPR-10的目標，為其活性研究做基礎，同時也為其他同源相關蛋白的體外表達提供可參考策略。需要注意的是，目前AmPR-10展現的核酸酶活性并不理想，也沒有文獻報道其有關抑菌作用的活性，因此后期可考慮深入其生物學活性的探索。通過基因進化等相關技術獲得高活性或對底物有廣譜性催化作用的目的蛋白，不僅有利于理解黃芪生長發育、抗病免疫的機制，對于抗病毒抗菌制劑的開發也具有重要意義。